青霉素和头孢霉素等β-内酰胺类抗生素的发现与使用为人类抵抗细菌感染作出了贡献，挽救了无数人的生命。但是在长期使用中，细菌逐渐对其产生抗药性，使其抗菌作用减弱或消失，经常出现使用效果不理想的现象。β-内酰胺酶的产生是革兰氏阴性菌对该类抗生素耐药的主要机制之一，临床上的β-内酰胺酶主要是ESBLs、AmpC酶和MBL。研究认为质粒携带的β-内酰胺酶耐药基因在质粒间及质粒与染色体间转移主要是通过转座子或整合子为工具实现的。整合子系统作为一种可移动的遗传元件，可捕获和整合细菌的耐药基因，在细菌耐药基因的水平传播中起到重要的作用。 目的：以医院感染中常见致病菌多重耐药革兰氏阴性菌为对象，检测β-内酰胺酶表型、β-内酰胺酶基因和整合子，了解其耐药特性、基因种类和分布特点；找到可诱导DHA-1与ACT-1型AmpC酶，为下一步的蛋白质组学研究打下基础，明确整合子机制在多重耐药中的作用。为指导临床合理应用抗生素，预防和控制耐药菌及耐药基因的传播提供科学的依据。 方法：纸片扩散初筛法从临床分离的302株多重耐药革兰氏阴性杆菌中筛选出80株可疑产酶株，然后用纸片扩散确证法、头孢西丁三维试验、MBL的协同试验进行确证；采用法国梅里埃API生化鉴定试条：经VITEK-2鉴定系统鉴定细菌到种；药敏试验用K-B法，经WHONET5.0软件进行统计学分析，分析其耐药特性；用多重PCR技术检测A、B、C、D4组β内酰胺酶基因和整合子，PCR产物经纯化后进行T-A克隆和DNA测序，进行基因分型；对新型CMY型AmpC编码基因进行克隆和序列分析，了解其突变的情况；用套式PCR技术和接合试验探讨CMY型AmpC转移的途径。 结果 一、β-内酰胺酶表型试验的检出率 302株革兰氏阴性杆菌β-内酰胺酶的表型试验筛选出80株可疑产酶株，总检出率为26.49％(80/302)。其中主要由产ESBLs引起的，占17.55％(53/302)；其次为ESBLs+AmpC引起，占6.62％(20/302)；为ESBLs+AmpC+MBL引起，占1.65％(5/302)，单独由AmpC引起的仅占0.66％(2/302)。 二、多重耐药革兰阴性杆菌的耐药谱 80株产β-内酰胺酶多重耐药革兰阴性杆菌对临床常用抗生素耐药率最低为丁氨卡那(18.99％)、其次为亚胺培南(20.0％)，头孢哌酮/舒巴坦(21.7％)、哌拉西林/他唑巴坦(21.89％)；最高为氨苄西林(98.33％)，其次为氨苄西林/舒巴坦(83.33％)、头孢曲松(76.25％)、头孢西丁(63.64％)及头孢噻肟(60.50％)等，大部分细菌呈多重耐药性。 三、PCR反应及序列测定结果 1.β-内酰胺酶基因的扩增结果 TEM、SHV、CTX-M-G1、CTX-M-G2、CTX-M-G3、PSE、DHA-1、ACT-1、CMY、IMP1及Int总阳性率在本院临床分离的80株β-内酰胺酶多重耐药革兰阴性杆菌中分别为：19.20％(58/302)、8.94％(27/302)、10.60％(32/302)、0.33％(1/302)、0.33％(1/302)、1.97％(6/302)、0.99％(3/302)、4.64％(14/302)、0.99％(3/302)、0.33％(1/302)及16.5％(50/302)。产β-内酰胺酶多重耐药革兰氏阴性杆菌株的总阳性率24.83％(75/302)，单产ESBLs的多重耐药革兰氏阴性杆菌株占17.55％(53/302)，同时产ESBLs与AmpC的菌株占6.95％(21/302)，ESBLs、MBL与AmpC的菌株占0.33％(1/302)，单产AmpC的菌株占0.33％(1/302)。找到一种广州地区未报道过的基因：CTX-M-15和一种新型CMY型AmpC酶。大部分多重耐药革兰氏阴性杆菌都携带4-6种β-内酰胺酶。 2.整合子序列PCR扩增结果 整合子检测结果：对80株产β-内酰胺酶多重耐药革兰氏阴性菌用兼并引物进行PCR反应，有50株检出整合子。有21.2％的菌株同时对十种抗生素都耐药，依次为氨卞西林(72.5％)、头孢曲松(62.5％)、头孢唑啉(61.2％)、头孢他啶(56.2％)、哌拉西林(55.0％)、复方磺胺嘧啶(51.2％)、环丙沙星(50％)、庆大霉素(48.8％)、头孢吡肟(48.8％)、头孢西丁(33.8％)，显著高于整合子阴性的菌株；用可变引物进行PCR反应，有29株检出Ⅰ类整合子，兼并引物的检出率比可变引物的高，可变引物可扩增出1000bp，1450bp，1600bp，1700bp，1850bp，1900bp，大于2000bp等多种不同长度的DNA片段。同一菌属携带有不同的耐药基因片段，不同菌属携带有相同的耐药基因片段。 3.新型CMYAmpC酶编码基因的克隆和序列分析 扩增CMY全序列，经T-A克隆后经测序发现：在中间序列发生了多处的突变，与CMY-2、CMY-Y4与CMY-22序列各有97％的同源性，氨基酸序列与CMY-13有98％的同源性，对头孢噻肟、头孢他啶、头孢吡肟、头孢西丁等多种抗生素耐药，是两种新型的CMY基因型，GenBank登陆号为：DQ443436、DQ443437。整合子用套式PCR扩增未发现CMY条带，对整合子基因盒插人区的扩增片段进行分子克隆和DNA序列分析，整合子并未发现CMY基因。接合试验显示CMY基因可通过质粒转移。 结论 1.用PCR反应检测β-内酰胺酶的基因简便、准确。此次检出本院多重耐药革兰氏阴性杆菌β-内酰胺酶的基因型有：TEM、SHV、CTX-M-G1、CTX-MM-G2、CTX-M-G3、PSE、DHA-1、ACT-1、CMY、IMP1，以单产ESBLs的为主17.55％(53/302)，同时产ESBLs与AmpC的菌株占21/302(6.95％)，大部分多重耐药革兰氏阴性杆菌都携带4-6种β-内酰胺酶。 2.整合子广泛分布于我院的多重耐药革兰氏阴性杆菌中，质粒定位和整合子介导的抗药性基因盒可能是导致产酶株多重耐药性产生和(或)播散的重要原因。 3.筛选出DHA-1与ACT-1可诱导型AmpC酶，为进一步研究AmpC酶耐药机制的蛋白质组学打下基础。发现两种不同的新型CMY型AmpC酶，GenBank登陆号为：DQ443436、DQ443637，为研究AmpC酶的起源和进化提供依据。找到一种广州地区未报道过的ESBLs基因型：CTX-M-15。