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目的:
缺血性脑卒中属于中医学“中风”范畴，历代医家运用中医药治疗中风历史悠久，临床上积累了丰富的经验，有较好的疗效。中药阳雀花根具有益气活血通络之功，民间和少数民族地区常用治疗偏瘫，其植物名锦鸡儿，课题组前期研究表明锦鸡儿根具有耐缺血缺氧作用，其主要有效成分锦鸡儿总黄酮(Total flavonoids in Caragana,TFC)对脑缺血损伤和脑血管内皮细胞缺血缺氧损伤具有保护作用，但对促进神经功能恢复的机制尚不清楚。现代医学研究证实，脑缺血后三级侧枝循环的建立是促进神经功能恢复的机制之一，其中促进血管新生是治疗缺血性脑血管病的重要手段，因此本研究拟从调控血管新生的HIF-1-VEGF-Notch信号通路途径，探讨锦鸡儿总黄酮对脑缺血后脑保护的影响及其改善脑血流灌注的机制。
方法:
制作大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤(MCAO/R)模型，设假手术组、模型组和TFC(60、30、15mg/kg)不同剂量治疗组，验证锦鸡儿总黄酮对脑缺血急性期的脑保护作用，于脑缺血1.5h再灌注3小时后给予药物干预，TFC治疗组分别予TFC60mg/kg、TFC30mg/kg、TFC15mg/kg灌胃，假手术组和模型组予等体积生理盐水灌胃，脑缺血再灌注24h后进行神经功能缺损评分，取脑组织行TTC染色评价脑梗死体积的变化:在此基础上探索锦鸡儿总黄酮改善脑血流灌注的机制，于脑缺血1.5h再灌注3小时后给予药物干预，TFC治疗组分别予TFC60mg/kg、TFC30mg/kg、TFC15mg/kg，假手术组和模型组予等体积生理盐水，每天1次，灌胃给药，连续治疗14天，于末次给药2小时后行激光散斑血流成像评估各组脑血流灌注情况，然后取脑组织分别用免疫荧光、Western blot及PCR检测缺血脑组织中CD31、Ang-1、VEGF、D114、HIF-1α及Notch1等蛋白和基因的表达情况。
结果:
1.脑缺血再灌注24小时后，与假手术组相比，模型组和各治疗组神经功能缺损明显(**P＜0.01)。与模型组比较，TFC60mg/kg、TFC30mg/kg治疗组神经功能评分明显降低(*P＜0.05)，且TFC60mg/kg)治疗组最为显著(++P＜0.01)。
2.脑缺血再灌注24小时后，与假手术组相比，模型组及各治疗组缺血脑组织均出现大面积梗死区域，具有显著差异(**P＜0.01)。与模型组相比，经TFC60mg/kg、30mg/kg、15mg/kg治疗组梗死体积缩小，且呈剂量依赖性(**P＜0.05，***P＜0.01)。与低剂量治疗组(TFC15mg/kg)相比，高剂量组(TFC60mg/kg)可显著降低脑梗死体积(+P＜0.05)。
3.脑缺血再灌注14天后，假手术组大鼠两侧脑血流灌注无明显差异;与健侧比较，模型组及TFC(60mg/kg、30mg/kg、15mg/kg)各治疗组缺血侧脑血流量较健侧明显减少，TFC60mg/kg组对脑血流的影响最为显著。
4.脑缺血再灌注14天后，免疫荧光结果提示TFC治疗组脑缺血半暗带CD31、Ang-1及VEGF的表达量较模型组增多，60mg/kg治疗组差异最为显著。Western blot结果显示，与假手术组相比，模型组和TFC60mg/kg、30mg/kg、15mg/kg治疗组缺血脑组织中CD31、Ang-1及VEGF蛋白表达量增多，差异有统计学意义(**P＜0.05，***P＜0.01)。PCR结果显示与假手术组相比，模型组和TFC60mg/kg、30mg/kg、15mg/kg治疗组缺血脑组织中CD31、Ang-1及VEGF mRNA表达量均明显升高，且TFC60mg/kg治疗组显著高于模型组(**P＜0.01)。
5.脑缺血再灌注损伤14天后，与模型组相比，TFC60mg/kg组脑缺血半暗带D114、HIF-1和Notch1表达量增多。Westem blot结果显示，与模型组相比，TFC60mg/kg治疗组脑组织缺血半暗带区D114、HIF-1、Notch1蛋白表达显著上调，差异具有统计学意义(*P＜0.05，#P＜0.05，**P＜0.01)。
结论:
1.锦鸡儿总黄酮对大鼠脑缺血再灌注损伤急性期具有脑保护作用，可改善脑缺血损伤后的神经功能缺失，减小脑梗死体积。
2.锦鸡儿总黄酮连续用药14天后能够有效促进脑卒中大鼠缺血半暗带区的血流灌注，其作用机制与上调缺血半暗带区CD31、Ang-1、VEGF、D114、HIF-1、Notch1蛋白的表达，促进血管新生有关。
缺血性脑卒中属于中医学“中风”范畴，历代医家运用中医药治疗中风历史悠久，临床上积累了丰富的经验，有较好的疗效。中药阳雀花根具有益气活血通络之功，民间和少数民族地区常用治疗偏瘫，其植物名锦鸡儿，课题组前期研究表明锦鸡儿根具有耐缺血缺氧作用，其主要有效成分锦鸡儿总黄酮(Total flavonoids in Caragana,TFC)对脑缺血损伤和脑血管内皮细胞缺血缺氧损伤具有保护作用，但对促进神经功能恢复的机制尚不清楚。现代医学研究证实，脑缺血后三级侧枝循环的建立是促进神经功能恢复的机制之一，其中促进血管新生是治疗缺血性脑血管病的重要手段，因此本研究拟从调控血管新生的HIF-1-VEGF-Notch信号通路途径，探讨锦鸡儿总黄酮对脑缺血后脑保护的影响及其改善脑血流灌注的机制。
方法:
制作大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤(MCAO/R)模型，设假手术组、模型组和TFC(60、30、15mg/kg)不同剂量治疗组，验证锦鸡儿总黄酮对脑缺血急性期的脑保护作用，于脑缺血1.5h再灌注3小时后给予药物干预，TFC治疗组分别予TFC60mg/kg、TFC30mg/kg、TFC15mg/kg灌胃，假手术组和模型组予等体积生理盐水灌胃，脑缺血再灌注24h后进行神经功能缺损评分，取脑组织行TTC染色评价脑梗死体积的变化:在此基础上探索锦鸡儿总黄酮改善脑血流灌注的机制，于脑缺血1.5h再灌注3小时后给予药物干预，TFC治疗组分别予TFC60mg/kg、TFC30mg/kg、TFC15mg/kg，假手术组和模型组予等体积生理盐水，每天1次，灌胃给药，连续治疗14天，于末次给药2小时后行激光散斑血流成像评估各组脑血流灌注情况，然后取脑组织分别用免疫荧光、Western blot及PCR检测缺血脑组织中CD31、Ang-1、VEGF、D114、HIF-1α及Notch1等蛋白和基因的表达情况。
结果:
1.脑缺血再灌注24小时后，与假手术组相比，模型组和各治疗组神经功能缺损明显(**P＜0.01)。与模型组比较，TFC60mg/kg、TFC30mg/kg治疗组神经功能评分明显降低(*P＜0.05)，且TFC60mg/kg)治疗组最为显著(++P＜0.01)。
2.脑缺血再灌注24小时后，与假手术组相比，模型组及各治疗组缺血脑组织均出现大面积梗死区域，具有显著差异(**P＜0.01)。与模型组相比，经TFC60mg/kg、30mg/kg、15mg/kg治疗组梗死体积缩小，且呈剂量依赖性(**P＜0.05，***P＜0.01)。与低剂量治疗组(TFC15mg/kg)相比，高剂量组(TFC60mg/kg)可显著降低脑梗死体积(+P＜0.05)。
3.脑缺血再灌注14天后，假手术组大鼠两侧脑血流灌注无明显差异;与健侧比较，模型组及TFC(60mg/kg、30mg/kg、15mg/kg)各治疗组缺血侧脑血流量较健侧明显减少，TFC60mg/kg组对脑血流的影响最为显著。
4.脑缺血再灌注14天后，免疫荧光结果提示TFC治疗组脑缺血半暗带CD31、Ang-1及VEGF的表达量较模型组增多，60mg/kg治疗组差异最为显著。Western blot结果显示，与假手术组相比，模型组和TFC60mg/kg、30mg/kg、15mg/kg治疗组缺血脑组织中CD31、Ang-1及VEGF蛋白表达量增多，差异有统计学意义(**P＜0.05，***P＜0.01)。PCR结果显示与假手术组相比，模型组和TFC60mg/kg、30mg/kg、15mg/kg治疗组缺血脑组织中CD31、Ang-1及VEGF mRNA表达量均明显升高，且TFC60mg/kg治疗组显著高于模型组(**P＜0.01)。
5.脑缺血再灌注损伤14天后，与模型组相比，TFC60mg/kg组脑缺血半暗带D114、HIF-1和Notch1表达量增多。Westem blot结果显示，与模型组相比，TFC60mg/kg治疗组脑组织缺血半暗带区D114、HIF-1、Notch1蛋白表达显著上调，差异具有统计学意义(*P＜0.05，#P＜0.05，**P＜0.01)。
结论:
1.锦鸡儿总黄酮对大鼠脑缺血再灌注损伤急性期具有脑保护作用，可改善脑缺血损伤后的神经功能缺失，减小脑梗死体积。
2.锦鸡儿总黄酮连续用药14天后能够有效促进脑卒中大鼠缺血半暗带区的血流灌注，其作用机制与上调缺血半暗带区CD31、Ang-1、VEGF、D114、HIF-1、Notch1蛋白的表达，促进血管新生有关。