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乙偶姻作为一种重要的食品添加剂和平台化合物,广泛应用于食品、化工和农业等行业。本论文以食品安全菌株Bacillus subtilis168为研究对象,通过敲除基因sigF,sigE,bdhA,ldh和ackA,并在发酵中后期加强表达α-乙酰乳酸合成酶（ALS）和α-乙酰乳酸脱羧酶（ALDC）,以阻断芽孢的生成和减少副产物的积累,进而加强乙偶姻合成途径代谢流量。利用Cre/lox敲除体系分别敲除芽孢合成关键应答调节蛋白基因spo0A和芽孢特异性σ因子编码基因sigF、sig E,得到重组菌B.subtilis△spo0A和BSD1。spo0A基因的敲除成功的在芽孢合成起始阶段阻断了芽孢的产生;而sigF和sig E基因的共敲除成功的在芽孢合成不对称分裂阶段阻断了芽孢的产生,同时重组菌BSD1的细胞形态在芽孢形成阶段发生了变化,在细胞的两端各形成了一个类似前芽孢的细胞室。spo0A基因的缺失在一定程度上抑制了B.subtilis△spo0A的生长,菌体浓度下降了31.0%,乙偶姻产量降低了13.5%;而sigF和sigE基因的缺失对重组菌BSD1细胞的生长及乙偶姻的合成均无显著的影响。实验结果表明,阻断芽孢的合成不能提高乙偶姻的产量,敲除基因sigF和sigE是阻断芽孢形成的最优策略。通过敲除乙偶姻还原酶基因bdhA、乳酸脱氢酶基因ldh和乙酸激酶基因ackA,分别阻断副产物2,3-丁二醇、乳酸和乙酸的合成。bdhA基因的敲除阻断了乙偶姻与2,3-丁二醇的相互转化,发酵周期缩短,乙偶姻产量达到29.99 g·L-1,生产效率从0.24 g·L-1·h-1上升到0.36 g·L-1·h-1。同时乙酸、乳酸和琥珀酸的产量也有所提高,发酵结束时发酵液中仍有6.84 g·L-1的2,3-丁二醇,表明枯草芽孢杆菌中还存在其他具有乙偶姻还原酶活性的酶。ldh基因的敲除提高了菌体的生物量,乙偶姻产量得到进一步提高,达到32.87g·L-1,乳酸产量降低了79.4%,乙酸和琥珀酸的产量分别提高了52.7%、12.3%。ackA基因的缺失对菌株合成乙偶姻无显著影响,虽然乙酸激酶的酶活降低了88.9%,但乙酸产量基本没有变化。利用自诱导启动子在发酵中后期共表达ALDC和ALS,加强乙偶姻的合成。比较了几个自诱导启动子在发酵中后期的表达能力,研究发现启动子PsrfA在发酵前期活性较低,在36 h后活性迅速上升,显著的提高了ALDC和ALS的酶活。通过摇瓶发酵,重组菌BSD4/pMA5-PsrfA-alsSD的乙偶姻产量达到39.08 g·L-1,比菌株BSD4提高了18.0%,摩尔得率达到0.79 mol·mol-1。乙偶姻合成途径代谢流的加强,使副产物乙酸和琥珀酸的产量分别下降了25.0%、24.3%,而2,3-丁二醇和乳酸的产量基本无变化。对重组菌BSD4/pMA5-Psrf A-alsSD进行分批补料发酵试验,乙偶姻产量提高至46.57 g·L-1,生产效率达到0.49 g·L-1·h-1,摩尔得率为0.74 mol·mol-1,实现了乙偶姻的高效合成。