背景:作为单通道光度法双酶同测(SDESA-ELISA)的候选标记酶-绿脓杆菌芳香基硫酸酯酶(PAAS)结构已知,但存在比活较低与37℃热稳定性较差这些问题,难以满足应用的需要。因此,需要对此酶进行分子工程改造,目前,定点突变因其高效性更多应用于实际操作中。目的:定点突变辅助分析构效关系,获得高活性高稳定性的芳香硫酸酯酶,作为SDESA-ELISA合适的标记酶。方法:在活性中心周围,针对催化区域进行定点突变,经测序确认后,目的片段与含6-His标签的PET-24a载体结合,构成重组质粒;经转化感受态细胞,培养诱导表达,菌体裂解,蛋白纯化后;表征各突变体;根据出现的特殊现象进一步分析,再依据结果进行新一轮设计得到相应的突变体并表征。基本性质表征:包括SDS-PAGE,PAGE比活,酶反应动力学参数,最适pH,金属离子影响等相关酶学性质;反应中失活现象探究:各突变体反应动力学曲线对比,产物的抑制作用及反应期此酶稳定性,针对M72K进行磁珠吸附分离释放再反应;MALDI-TOF及超高分辨质谱直接检测酶分子在反应期是否发生修饰作用;对PAAS和各定点突变体的热稳定性进行监测:考察其处于37℃和4℃的半衰期;针对特殊现象,以同条件下野生型进行同期对比,并进行紫外吸收,荧光发射,同步荧光光谱扫描;以MALDI-TOF判断是否发生修饰作用。针对PAAS换用不同类型的缓冲液储存,考察37℃热稳定性差异。结果:活性中心位置附近定点突变对此酶的各项性质影响很大。与野生型PAAS相比,最适pH,金属离子影响等方面均出现显著改变;其中R55K(几乎失活),K375(针对底物专一性发生改变),M72系列(动力学参数下降约2个数量级)的改变最为突出;PAAS及其大多数突变体作用于其天然底物对硝基苯硫酸钾(PNS)时,均出现随反应时间延长,动力学曲线发生明显弯曲的现象(反应中失活现象),尤其是M72系列突变体;经MALDI-TOF及超高分辨质谱结果显示在反应过程中可能此酶发生了硫酸化修饰作用。观察到突变体M72K 37℃pH7.4储存于不同缓冲液中均存在显著的热激活现象,(即在一定时间内37℃p H7.4缓冲液中,M72K随储存时间延长,对PNS比活明显增加,超过两个数量级;)同步追踪其吸收光谱与荧光光谱并与野生型PAAS在相同条件下进行比较,出现了明显改变;而PAAS 37℃储存于不同缓冲液中,热稳定性差异较大,处于10mM pH7.4硼酸硼砂时,半衰期得到明显延长。结论:通过定点突变后,PAAS各定点突变体酶学性质发生巨大改变,甚至出现特殊现象;这为初步探究构效关系提供一定依据。