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目的:基于脑肠轴这个新兴的领域,以缺血性脑卒中后肠道微生态紊乱为切入点。初步研究通窍活血汤(Tongqiao Huoxue Decoction,TQHXD)对脑缺血再灌注(ischemia reperfusion,I/R)炎症损伤大鼠的保护作用。方法:1.TQHXD对脑缺血再灌注损伤大鼠的保护作用(1)采用MCAO建立脑缺血2h再灌注24h模型,并选用Longa五级四分制评分法进行神经功能缺损评分,筛选模型1-3分大鼠用于实验;并对给药后第1d、7d、14d后各组大鼠进行神经行为学评分。(2)氯化三苯四唑(2,3,5-three phenyl tetrazole chloride,TTC)染色法检测TQHXD对I/R大鼠脑梗死体积的影响。(3)苏木精-伊红染色(hematoxylin-eosin staining,HE)法观察TQHXD对I/R大鼠脑组织病理切片的影响。2.TQHXD对脑缺血再灌注大鼠肠道微生态紊乱的调节作用(1)对大鼠粪便进行肠道细菌16Sr RNA高通量测序,观察TQHXD对I/R大鼠肠道微生物紊乱的影响。(2)通过HE染色观察TQHXD对I/R大鼠小肠形态学变化的影响。(3)通过透射电镜(Transmission electron microscope,TEM)观察TQHXD对I/R大鼠小肠紧密连接结构变化的影响。(4)蛋白质免疫印迹法(Western Blotting,WB)检测TQHXD对I/R大鼠小肠紧密连接蛋白ZO-1、Claudin-2蛋白水平表达的影响。(5)酶联免疫吸附测定(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)法检测TQHXD对I/R大鼠血浆中二胺氧化酶(diamine oxidase,DAO)、D-乳酸、内毒素(Lipopolysaccharides,LPS)浓度大小的影响。3.TQHXD对脑缺血再灌注大鼠肠道微生态紊乱诱导的炎症损伤的调节作用(1)采用流式细胞仪技术检测TQHXD对I/R大鼠外周血中Treg细胞、γδT细胞比例变化的影响(2)免疫组织化学技术法检测TQHXD对I/R大鼠小肠、脾脏、缺血侧脑组织中Treg细胞、γδT细胞的分布情况的影响。(3)通过ELISA法检测TQHXD对I/R大鼠脑组织中IL-17、IL-10的表达水平的影响。4.粪便微生物移植对脑缺血再灌注损伤大鼠转归的影响(1)每天取大鼠新鲜粪便进行制备大鼠粪便微生物上清液,现取现用。(2)通过TTC染色法检测粪便微生物移植(Fecal microbiota transfer,FMT)对I/R大鼠脑梗死体积的影响。(3)免疫组织化学技术法检测FMT对I/R大鼠小肠、脾脏、缺血侧脑组织中Treg细胞、γδT细胞的分布情况的影响。(4)通过ELISA法检测FMT对I/R大鼠脑组织中IL-17、IL-10的表达水平的影响。结果:1.TQHXD对I/R损伤大鼠的保护作用(1)神经行为学功能缺损评分结果显示:给予TQHXD 7d和14d后,神经功能缺损评分明显降低(2)TTC脑梗死染色结果:与模型组相比,TQHXD组不同时间点均可显著减少脑梗死体积,具有统计学意义。(3)HE病理染色结果表明:假手术组大鼠细胞核完整,细胞排列紧密,模型组大鼠缺血侧脑组织细胞结构疏松,神经元细胞减少,细胞肿胀,呈现明显的缺血灶。给药7d和14d后,TQHXD组能够不同程度改善细胞病理损伤。2.TQHXD对脑缺血再灌注大鼠肠道微生态紊乱的调节作用(1)大鼠粪便16Sr RNA高通量测序表明:TQHXD组可以改善模型组大鼠肠道菌群主成分的变化,降低拟杆菌门比例的过度增加,调节乳酸杆菌属的紊乱,增加双歧杆菌属的比例。(2)HE小肠病理切片染色结果:与假手术组相比,模型组微绒毛稀疏排列紊乱,长短不一;杯状细胞减少。TQHXD组不同时间点与模型组相比都有不同程度改善。(3)TEM结果显示:假手术组紧密连接结构和桥粒细胞清晰可见,模型组7d和14d紧密连接条带暗淡甚至消失,桥粒细胞消失,TQHXD组不同时间点有不同程度的改善。(4)WB结果表明:与模型组相比,TQHXD组可以增加紧密连接蛋白ZO-1的表达,降低Claudin-2的表达。(5)ELISA法检测显示:与假手术组相比,模型组血浆中DAO、D-乳酸、LPS浓度明显增高。TQHXD组与模型组相比,不同时间点血浆中DAO、D-乳酸、LPS浓度明显降低。3.TQHXD对脑缺血再灌注大鼠肠道微生态紊乱诱导的炎症损伤的调节作用(1)流式细胞术检测结果表明:与假手术组相比,模型组γδT细胞数量显著增加,与模型组相比TQHXD组Treg细胞显著增加,γδT细胞数量显著减少。(2)免疫组化法显示:模型组与假手术组相比,小肠上皮组织,缺血侧脑组织γδT细胞分布明显增加。TQHXD组与模型组相比,小肠上皮组织、缺血侧脑组织γδT细胞分布明显降低,小肠上皮组织、脾脏组织、缺血侧脑组织Treg细胞明显增加。(3)ELISA法检测表明:与假手术组相比,模型组缺血侧脑组织IL-17明显增加。与模型组相比TQHXD组缺血侧脑组织IL-10明显增加,IL-17明显降低。4.粪便微生物移植对脑缺血再灌注损伤大鼠转归的影响(1)TTC染色结果显示:与模型组相比,Sham(FMT)组和Sham+TQHXD(FMT)组脑梗死体积都明显降低。(2)免疫组织化学技术法检测表明:模型组小肠组织和缺血侧脑组织γδT细胞明显增加。与模型组相比,Sham(FMT)组和Sham+TQHXD(FMT)组小肠组织和缺血侧脑组织γδT细胞明显降低,Treg细胞明显增加。(3)ELISA法检测结果表明:模型组缺血侧脑组织IL-17明显增加,Sham(FMT)组和Sham+TQHXD(FMT)组与模型组相比IL-17明显降低,而IL-10明显增加。结论:综合以上结果表明,TQHXD对脑缺血再灌注损伤的大鼠具有明显的保护作用,而这种保护作用可能是通过调节了缺血性脑卒中后大鼠肠道微生态的紊乱,进而抑制了因肠道微生态紊乱而诱发的炎症反应有关。