高温大曲中产香微生物的筛选及应用研究

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大曲对于白酒的质量和产量起到至关重要的作用。本文以高温大曲为研究对象,通过高通量测序探究大曲主要微生物群落及变化规律。测定不同发酵阶段大曲挥发性香气物质,考察香气变化规律。从大曲筛选产香优势细菌并应用到大曲发酵,测定强化大曲吡嗪类物质含量和酶活力。将筛得的产香优势酵母菌株应用于酒醅发酵,测定酒样中的骨架香气成分。得到如下结果:1.对不同发酵阶段大曲进行高通量测序,结果共检出60个细菌属和41个真菌属。在12个优势细菌属中,芽孢杆菌属相对丰度先升高后降低,糖多孢菌属逐渐降低,克罗彭施泰特氏菌属和葡萄球菌属逐渐升高;在8个优势真菌属中,嗜热真菌属丰度不断升高,嗜热子囊菌属和根霉属先上升后下降。对细菌和真菌进行spearman相关性分析,克罗彭施泰特氏菌属和亚细亚菌属与大多数真菌有显著正相关性,而乳杆菌属和片球菌属与真菌有着明显负相关性。丰度较高的芽孢杆菌属与嗜热真菌属呈负相关性。此外,结果表明大曲发酵阶段细菌的物种多样性先升高后降低,而真菌物种多样性不断降低。2.采用顶空固相微萃取及气相色谱-质谱联用技术(Headspace solid-phase microextraction-gas chromatography-mass spectrometry,HS-SPME-GC-MS)对不同发酵阶段大曲的挥发性香气物质进行测定。首先优化HS-SPME条件,从高温大曲中共检出吡嗪类、芳香类、酸类、醇类、酯类、酮类和醛类等67种风味物质,其中吡嗪类、芳香类、酸类物质含量较高。随发酵进行,吡嗪类物质含量不断升高,在出仓大曲中高达328.42 mg/kg;而芳香类和酸类物质含量随发酵先升高后降低,在二次翻仓大曲中分别为249.09 mg/kg和78.02 mg/kg。3.经高温培养初筛和固态发酵产香复筛,从大曲中得到六株高产吡嗪菌株。对代谢产物和大曲香气进行比较,发现细菌发酵对大曲风味贡献烘焙香、烤香和酱香。经鉴定6株菌株均为芽孢杆菌属,将6株菌株制备液态和固态两种菌剂应用到大曲发酵。发酵结束后运用超高效液相色谱-串联质谱技术(Ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry,UPLC-MS/MS)对强化大曲的吡嗪类物质进行测定,结果表明强化大曲的吡嗪含量提升明显,并且液态菌剂的效果要普遍优于固态菌剂。其中X1强化大曲的四甲基吡嗪、2.3.5-三甲基吡嗪、2.6-二甲基吡嗪含量分别高达23280μg/kg、4880μg/kg、8880μg/kg,相比对照大曲分别提升2.36、2.56、2.33倍。又对强化大曲酶活力进行测定,实验结果表明菌株X1、X8能够显著提高大曲中性和酸性蛋白酶酶活力。4.经过液态发酵产香初筛和固态发酵产香复筛,从高温大曲中筛得两株产香优势酵母菌Y3和Y5,其代谢产物分别检出43种和37种挥发性香气化合物。Y3固态发酵产物主要香气成分为β-苯乙醇、异戊醇、异戊酸;Y5固态发酵产物主要香气成分为β-苯乙醇、4-乙烯基愈创木酚。通过与大曲香气比较分析,发现酵母菌发酵主要对大曲贡献花香和水果香。经鉴定Y3为扣囊复膜酵母(Scchromycopsis fibuliger),Y5为异常威克汉姆酵母(Wickerhamomyces anomalus)。将Y3、Y5添加至酱香型白酒酒醅中模拟生产发酵,使用GC测定骨架成分。结果表明,Y3和Y5能够显著提升酒中乙酸乙酯、乳酸乙酯和β-苯乙醇的含量。
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