【摘 要】
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葛根(Pueraria lobata)是中国卫生部批准的药食同源藤本植物,既有药用价值,又有营养保健之功效,葛根作为古代中药处方和中成药中潜在的降糖和食用中草药候选药物,目前以葛根为君药上市的复方制剂和保健品有葛根苦瓜铬胶囊、蜂胶葛根软胶囊、葛根咀嚼片和野葛根粉等。葛根多糖作为其潜在的有效成分或活性成分备受学者关注,在医疗保健和绿色食品上得到广泛应用。基于葛根多糖的研究现状,本文将从葛根中提取分离
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葛根（Pueraria lobata）是中国卫生部批准的药食同源藤本植物,既有药用价值,又有营养保健之功效,葛根作为古代中药处方和中成药中潜在的降糖和食用中草药候选药物,目前以葛根为君药上市的复方制剂和保健品有葛根苦瓜铬胶囊、蜂胶葛根软胶囊、葛根咀嚼片和野葛根粉等。葛根多糖作为其潜在的有效成分或活性成分备受学者关注,在医疗保健和绿色食品上得到广泛应用。基于葛根多糖的研究现状,本文将从葛根中提取分离纯化活性均一多糖,采用多种理化方法对结构进行解析,并基于Hep G2细胞来研究其体外降糖活性及其分子机制。葛根药材通过水提醇沉法得到葛根粗多糖,粗多糖采用大孔树脂HP-20、DEAE纤维素和Sephadex G-200凝胶层析柱分离纯化出5个均一多糖,总收率分别为PLP-1（0.13%）、PLP-2（0.18%）、PLP-3（0.03%）、PLP-4（0.01%）、PLP-5（0.08%）,相对平均分子量经高效凝胶渗透色谱法测定分别为PLP-1（16.2 k Da）、PLP-2（11.0 k Da）、PLP-3（6.2 k Da）、PLP-4（3.8 k Da）、PLP-5（1.6 k Da）,并采用苯酚-硫酸法测得均一多糖的总糖含量分别为PLP-1（96.6%）、PLP-2（98.4%）、PLP-3（94.3%）、PLP-4（94.4%）、PLP-5（96.8%）,Bradford法测得均一多糖的蛋白含量分别为PLP-1（2.4%）、PLP-2（1.8%）、PLP-3（2.4%）、PLP-4（4.7%）、PLP-5（4.0%）。均一多糖通过完全酸水解、还原和乙酰化生成糖醇乙酸酯衍生物,经GC-MS分析发现5个均一多糖（PLP-1、PLP-2、PLP-3、PLP-4、PLP-5）均是由葡萄糖构成,但是连接方式有所不同。因此,为了更详细的阐明均一多糖的结构,实验选取分子量最高的PLP-1进行深入研究,甲基化分析和核磁共振谱(1H-NMR谱、13C-NMR谱DEPT-135°谱、HSQC谱和HMBC谱)表明PLP-1的主链主要由→3)-α-D-Glcp（1→和→4）-β-D-Glcp(1→组成,相对摩尔比为7:1,原子力显微镜观察发现PLP-1在空间构型上呈现螺旋卷曲状。此外,通过0.5 mmol/L棕榈酸联合30 mmol/L葡萄糖共同诱导Hep G2细胞8 h,成功建立了体外胰岛素抵抗模型,并对此模型分别在8 h、16 h、24 h和32h进行了稳定性考察,结果发现胰岛素抵抗Hep G2细胞模型最长可持续24 h,实验选取盐酸二甲双胍（2 m M）为阳性对照,均一多糖设置为高（500μg/m L）、中（250μg/m L）、低（125μg/m L）3个浓度,分别与胰岛素抵抗Hep G2细胞共同孵育10 h,通过葡萄糖含量检测试剂盒筛选出均一多糖（PLP-1、PLP-2、PLP-3）的高浓度和中浓度具有体外降糖活性。为了进一步验证均一多糖降糖活性,本研究选取PLP-1（500μg/m L）,采用实时荧光定量PCR、Western blot和免疫荧光等方法,对其作用机制进行深入研究,实验结果表明,在胰岛素抵抗Hep G2细胞中,PLP-1上调PI3K、AKT、GSK-3β的m RNA和蛋白表达水平,下调Fox O1、PCK2、G6Pase的m RNA和蛋白表达水平,在Fox O1免疫荧光染色中,PLP-1能够降低Fox O1的表达并且抑制核转位。这些研究表明,PLP-1可能参与调节PI3K/AKT/GSK-3β和PI3K/AKT/Fox O1信号通路来促进糖原合成和改善糖代谢紊乱,为开发和利用葛根多糖作为一种替代的功能性食品或临床辅助治疗来改善糖尿病人群的代谢综合征提供科学依据。
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