【摘 要】
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半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)是我国北方传统的名贵鱼类,养殖规模大,分布范围广,社会经济效益高。弧菌病会引起养殖半滑舌鳎大量死亡,其中鳗弧菌(Vibrio anguillarum)是主要病原菌之一。但是,关于鳗弧菌感染后对半滑舌鳎的死亡率、组织病理损伤、免疫组织中的鳗弧菌负载量及炎症因子表达影响的相关研究较少,系统开展上述相关研究,对于解析细菌性病原对鱼类的病理损伤、制定
【基金项目】
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国家自然科学基金(41976102);
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半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)是我国北方传统的名贵鱼类,养殖规模大,分布范围广,社会经济效益高。弧菌病会引起养殖半滑舌鳎大量死亡,其中鳗弧菌(Vibrio anguillarum)是主要病原菌之一。但是,关于鳗弧菌感染后对半滑舌鳎的死亡率、组织病理损伤、免疫组织中的鳗弧菌负载量及炎症因子表达影响的相关研究较少,系统开展上述相关研究,对于解析细菌性病原对鱼类的病理损伤、制定相应的病害防治措施、减少养殖病害损失具有重要意义。本研究构建了不同浓度鳗弧菌感染半滑舌鳎炎症模型,包括低浓度组(low concentration group,LCG)、高浓度组(high concentration group,HCG)和对照组(control group,CG),其中,LCG和HCG组鳗弧菌浓度分别为6.4×10~5 CFU/g和6.4×10~6 CFU/g,并进行7 d的短期感染实验。通过对不同浓度炎症模型进行死亡率统计、常规病理切片、超微病理切片和鳗弧菌负载量变化分析等,评估鳗弧菌感染后半滑舌鳎免疫组织病理损伤情况及炎症程度。通过实时定量PCR方法,评估不同浓度组不同时间点半滑舌鳎免疫组织(肝、脾、肠和头肾)中炎症介质补体C5a、炎症因子(IL-6、IL-1β和TNF-α)和抑炎因子(IL-10)的m RNA表达水平变化,以期建立病原感染和宿主免疫应答的效应关系。本研究取得的研究结果如下:1.不同浓度炎症模型中半滑舌鳎死亡率分析LCG和HCG组12-24 h内半滑舌鳎大量死亡,24 h死亡率最高,48 h后死亡率显著降低。LCG和HCG组鳗弧菌感染后,半滑舌鳎集中死亡的时间节点为24 h。2.不同浓度炎症模型组织病理损伤分析LCG和HCG组半滑舌鳎免疫组织的病理损伤表现为:肝细胞肿胀、空泡化和炎性细胞浸润,脾红细胞坏死样,头肾损伤部位病理性出血,肠黏膜解离。超微病理损伤表现为:细胞膜、核膜破损,线粒体模糊、嵴断裂,小肠绒毛破损断裂。其次,通过对鳗弧菌感染后24 h的活体病鱼和死亡病鱼的解剖学观察发现,其解剖症状基本一致,均表现为腹水严重,泄殖腔肿大,肠红肿,肝脏呈土黄色,脾脏肿大等。LCG和HCG组病理损伤程度不同,HCG的病理损伤更严重,组织损伤部位出现大量中性粒细胞和嗜酸性粒细胞。LCG和HCG组24 h病理损伤最显著,48 h后病理损伤更轻。3.不同浓度炎症模型免疫组织中鳗弧菌负载量分析以毒力基因empA为靶基因,建立了SYBR Green I q PCR检测方法。通过该方法检测免疫组织中鳗弧菌负载量,结果表明鳗弧菌会侵袭半滑舌鳎的免疫组织并在组织内发生增殖。HCG组24 h肠中鳗弧菌负载量最高(4.33×10~6 copies/μL),血液中鳗弧菌负载量最低(2.10×10~4 copies/μL)。LCG组48 h肝脏中鳗弧菌负载量最高(6.10×10~4copies/μL),血液中鳗弧菌负载量最低(2.15×10~3 copies/μL)。HCG组免疫组织中24h、48 h和72 h的鳗弧菌负载量显著高于LCG组。研究发现,免疫组织中鳗弧菌负载量与感染浓度具有一定线性关系。4.不同浓度炎症模型免疫组织中炎症介质补体C5a、促炎因子和抑炎因子表达水平分析q PCR检测结果发现,健康半滑舌鳎中C5a、IL-1β、IL-6、TNF-α和IL-10在不同组织中广泛表达,但表达水平又存在较大差异。鳗弧菌感染后,LCG和HCG组不同免疫组织中炎症介质和3种炎症因子表达水平均升高且表达趋势相同,其中HCG组表达水平变化更显著。LCG和HCG组24 h脾脏和头肾中CsIL-10表达水平最高,而48 h肝脏和肠中CsIL-10表达水平最高,此时,各实验组中炎症因子表达量达到峰值或仍维持较高水平。研究发现,CsIL-10表达水平显著升高的时间点与炎症因子的表达水平相关,抑炎因子CsIL-10在维持免疫系统正常功能中具有重要作用。HCG组半滑舌鳎大量死亡,可能是由于高浓度鳗弧菌刺激后,补体CsC5a大量表达,进一步刺激了3种促炎因子高表达,炎症反应失控所致。本研究建立了不同浓度鳗弧菌感染半滑舌鳎的炎症模型,死亡率和组织病理损伤分析表明鳗弧菌感染后,半滑舌鳎集中死亡的时间节点为24 h。半滑舌鳎免疫组织中,鳗弧菌负载量与感染浓度具有一定线性关系,可应用于水产养殖业中,通过鳗弧菌负载量反推半滑舌鳎感染浓度。鳗弧菌感染浓度与半滑舌鳎死亡率、病理损伤程度、炎症介质补体C5a和炎症因子(IL-1β、IL-6和TNF-α)表达水平之间呈正相关。上述炎症指标变化可以为水产养殖鱼类中弧菌病的预警、防治和评估提供理论依据。
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