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基因组印记(genomic imprinting)是指由于亲本染色体差异表观遗传修饰(epigenetic modification)所导致的单等位基因表达。这些亲本来源特异性的单等位表达基因称为印记基因(imprinting gene)。在哺乳动物中，印记基因在胎儿生长发育、胎盘功能和出生后行为的调控中都起着重要的作用。近年来，随着对印记基因的广泛研究和深入理解，发现它对动物重要的经济性状和繁育至关重要。印记基因的表达紊乱是体细胞核移植动物(somatic cell nuclear transfer，SCNT)出生死亡和发育异常的重要因素。
然而，大多数印记基因的发现和研究都集中在人类和小鼠种，而在家畜上的研究还很少。本研究以牛DLK1-DIO3印记区域的LINC24065基因和GPR1-ZDBF2区域为研究对象，分析其在新生和成年阶段牛组织及胎盘中的印记和甲基化状态，同时也对新生死亡体细胞核移植牛组织进行了检测，得到以下研究结果:
1.利用RACE及RT-PCR技术，在牛DLK1-DIO3的印记域基因MEG8和MEG9之间，得到了一个具有6个可变剪接体(V1-V6)的长基因间非编码RNA(long intergenetic noncoding RNA，lincRNA)-LINC24065。分析其在组织中的表达发现，在新生小牛的7个组织(大脑、肾、肝、脾、肺、心和肌肉)中都表达;在出生死亡的体细胞核移植牛中没有检测到剪接体V3，另外5个剪接体均呈现组织特异性表达。应用基于SNP(Single nucleotide polymopisms)的RT-PCR直接测序法分析基因LINC2406的印记状态，发现基因LINC24065在新生小牛的7个组织和胎盘中都呈现母源基因特异性表达。然而，在出生死亡的体细胞核移植牛的脑组织中，表现出与其它6个组织不同的亲本特异性表达。
2.克隆了位于牛2号染色体上的GPR1，ZDBF2和LIZ基因。序列分析发现GPR1基因有4个可变剪接体(V1-V4)，并在新生和成年阶段牛的被检测的8个组织(大脑、肾、肝、脾、肺、心、脂肪和肌肉)中都表达。利用基于SNP的RT-PCR产物直接测序法，发现GPR1基因在新生和成年阶段牛组织中为单等位基因表达，通过对新生小牛父本和母本基因型检测，确定GPR1基因为父源等位基因特异性表达。在胎盘中，GPR1基因为双等位基因表达。在出生死亡的体细胞核移植牛中，各组织均为双等位基因表达。
3.利用RACE及RT-PCR技术，在成年牛脑组织中克隆到牛ZDBF2基因的3末端及完整的开放读码框(open reading frame，ORF)序列。利用杂合SNP位点，对基因ZDBF2在成年牛和新生小牛组织中的印记状态分析发现，在被检测的各组织中基因ZDBF2广泛表达，表现为单等位基因表达，并在新生小牛中确定了其父源等位基因表达的方式。与牛各组织中不同的是，基因ZDBF2在胎盘组织中为双等位基因表达。在出生死亡体细胞核移植牛中，只在少数组织(肝，脾，肾，肌肉和脑)中检测到ZDBF2基因的表达，且均为双等位基因表达。
4.在ZDBF2基因上游，利用4个ESTs序列克隆了基因LIZ，通过序列分析，将其鉴定为GPR1和ZDBF2基因间的长非编码RNA。利用RT-PCR在新生小牛和成年牛的8个组织中都没有检测到基因LIZ的表达，仅在胎盘中检测到了基因LIZ的表达。利用基于SNP的PCR直接测序法分析发现，在牛胎盘中LIZ基因表现为父源等位基因表达。
5.根据GPR1-ZDBF2印记域在人鼠中已鉴定的差异甲基化区(different methylation region，DMR)的序列结构特点，结合预测的牛ZDBF2基因启动子位置，确定了牛GPR1-ZDBF2印记域两个可能的DMR，其中G-DMR位于GPR1基因内含子3，Z-DMR位于ZDBF2基因启动子上游约17kb。利用亚硫酸氢盐测序法对G-DMR和Z-DMR的甲基化状态进行分析，发现G-DMR在卵母细胞为完全甲基化，精子中几乎不发生甲基化;在牛的大脑组织中G-DMR完全甲基化，在胎盘中是母源等位基因差异甲基化。Z-DMR在牛的精子中完全甲基化，在卵细胞中未甲基化;而在牛胎盘和脑组织中为亲本等位基因差异甲基化。G-DMR的甲基化状态与LIZ的表达方式一致，表明G-DMR调控了LIZ基因的表达。出生死亡的体细胞核移植牛在这3个预测的甲基化差异区，只在G-DMR区表现出与正常牛的显著差异，在各组织中失去了亲本特异性甲基化，与该印记域基因在出生死亡体细胞核移植牛中的异常表达相对应，说明G-DMR可能是牛GPR1-ZDBF2的印记调控区(ICR)。此外，还对GPR1-ZDBF2印记域中的CpG岛(CpGisland，CGI)的甲基化进行了分析，发现CGI在精子、卵母细胞、胎盘和牛脑组织中甲基化程度都低，表明该CGI区不参与该印记区的调控。
以上研究结果，不仅对牛基因组印记有了更多的了解，也为揭示体细胞核移植动物发育异常以及出生死亡的分子机理提供了一定的理论依据。
然而，大多数印记基因的发现和研究都集中在人类和小鼠种，而在家畜上的研究还很少。本研究以牛DLK1-DIO3印记区域的LINC24065基因和GPR1-ZDBF2区域为研究对象，分析其在新生和成年阶段牛组织及胎盘中的印记和甲基化状态，同时也对新生死亡体细胞核移植牛组织进行了检测，得到以下研究结果:
1.利用RACE及RT-PCR技术，在牛DLK1-DIO3的印记域基因MEG8和MEG9之间，得到了一个具有6个可变剪接体(V1-V6)的长基因间非编码RNA(long intergenetic noncoding RNA，lincRNA)-LINC24065。分析其在组织中的表达发现，在新生小牛的7个组织(大脑、肾、肝、脾、肺、心和肌肉)中都表达;在出生死亡的体细胞核移植牛中没有检测到剪接体V3，另外5个剪接体均呈现组织特异性表达。应用基于SNP(Single nucleotide polymopisms)的RT-PCR直接测序法分析基因LINC2406的印记状态，发现基因LINC24065在新生小牛的7个组织和胎盘中都呈现母源基因特异性表达。然而，在出生死亡的体细胞核移植牛的脑组织中，表现出与其它6个组织不同的亲本特异性表达。
2.克隆了位于牛2号染色体上的GPR1，ZDBF2和LIZ基因。序列分析发现GPR1基因有4个可变剪接体(V1-V4)，并在新生和成年阶段牛的被检测的8个组织(大脑、肾、肝、脾、肺、心、脂肪和肌肉)中都表达。利用基于SNP的RT-PCR产物直接测序法，发现GPR1基因在新生和成年阶段牛组织中为单等位基因表达，通过对新生小牛父本和母本基因型检测，确定GPR1基因为父源等位基因特异性表达。在胎盘中，GPR1基因为双等位基因表达。在出生死亡的体细胞核移植牛中，各组织均为双等位基因表达。
3.利用RACE及RT-PCR技术，在成年牛脑组织中克隆到牛ZDBF2基因的3末端及完整的开放读码框(open reading frame，ORF)序列。利用杂合SNP位点，对基因ZDBF2在成年牛和新生小牛组织中的印记状态分析发现，在被检测的各组织中基因ZDBF2广泛表达，表现为单等位基因表达，并在新生小牛中确定了其父源等位基因表达的方式。与牛各组织中不同的是，基因ZDBF2在胎盘组织中为双等位基因表达。在出生死亡体细胞核移植牛中，只在少数组织(肝，脾，肾，肌肉和脑)中检测到ZDBF2基因的表达，且均为双等位基因表达。
4.在ZDBF2基因上游，利用4个ESTs序列克隆了基因LIZ，通过序列分析，将其鉴定为GPR1和ZDBF2基因间的长非编码RNA。利用RT-PCR在新生小牛和成年牛的8个组织中都没有检测到基因LIZ的表达，仅在胎盘中检测到了基因LIZ的表达。利用基于SNP的PCR直接测序法分析发现，在牛胎盘中LIZ基因表现为父源等位基因表达。
5.根据GPR1-ZDBF2印记域在人鼠中已鉴定的差异甲基化区(different methylation region，DMR)的序列结构特点，结合预测的牛ZDBF2基因启动子位置，确定了牛GPR1-ZDBF2印记域两个可能的DMR，其中G-DMR位于GPR1基因内含子3，Z-DMR位于ZDBF2基因启动子上游约17kb。利用亚硫酸氢盐测序法对G-DMR和Z-DMR的甲基化状态进行分析，发现G-DMR在卵母细胞为完全甲基化，精子中几乎不发生甲基化;在牛的大脑组织中G-DMR完全甲基化，在胎盘中是母源等位基因差异甲基化。Z-DMR在牛的精子中完全甲基化，在卵细胞中未甲基化;而在牛胎盘和脑组织中为亲本等位基因差异甲基化。G-DMR的甲基化状态与LIZ的表达方式一致，表明G-DMR调控了LIZ基因的表达。出生死亡的体细胞核移植牛在这3个预测的甲基化差异区，只在G-DMR区表现出与正常牛的显著差异，在各组织中失去了亲本特异性甲基化，与该印记域基因在出生死亡体细胞核移植牛中的异常表达相对应，说明G-DMR可能是牛GPR1-ZDBF2的印记调控区(ICR)。此外，还对GPR1-ZDBF2印记域中的CpG岛(CpGisland，CGI)的甲基化进行了分析，发现CGI在精子、卵母细胞、胎盘和牛脑组织中甲基化程度都低，表明该CGI区不参与该印记区的调控。
以上研究结果，不仅对牛基因组印记有了更多的了解，也为揭示体细胞核移植动物发育异常以及出生死亡的分子机理提供了一定的理论依据。