肝硬化和肝癌是我国发病率和死亡率较高的两种肝病。目前，这两种肝病临床上均缺乏有效的治疗策略和靶向药物，主要原因为缺乏特异的靶向分子。为了鉴定肝硬化和肝癌特异的靶向分子，指导该肝病的临床治疗、改善患者预后，本研究通过结合高通量的蛋白质组学技术和高灵敏度的近红外二区成像技术建立起快速、高效的肝病靶向分子研究体系，并开展了肝硬化和肝癌靶向分子的鉴定及验证。本研究主要分为两部分：
　　1、蛋白质组学结合近红外二区成像研究肝靶向分子研究体系的建立，并鉴定到肝癌特异的靶向分子MCM2：
　　(1)MCM2在肝癌组织中显著上调。通过isobaricTagsforRelativeandAbsoluteQuantitation(iTRAQ)定量蛋白质组分析肝癌和癌旁样本，并通过差异表达蛋白分析鉴定到MCM2在肝癌组织中显著上调。
　　(2)通过组织芯片体外验证MCM2在肝癌组织中过表达。用MCM2抗体对100对肝癌和癌旁组织进行免疫组化染色，肝癌组织的阳性染色高达89.8%，而大部分癌旁组织的呈阴性染色，且MCM2在临床分期较高的肝癌组织中染色强度较高。
　　(3)根据TheCancerGenomeAtlas(TCGA)数据库中收录肝癌患者的癌和癌旁的RNAseq数据，MCM2的mRNA水平在肝癌组织中表达显著高于癌旁，与肝癌临床分期呈正相关，并且显著影响肝癌患者生存期。
　　(4)近红外二区荧光活体成像显示MCM2靶向肝癌组织。用HepG2肝癌细胞系建立小鼠肝癌皮下肿瘤模型，近红外二区荧光探针偶联MCM2抗体尾静脉注射到模型小鼠体内，活体和离体结果均显示在肿瘤部位出现高亮度荧光，显示MCM2对肝癌组织具有较高的靶向性和选择性。
　　(5)MCM2通过细胞周期蛋白影响肿瘤细胞周期和增殖。利用siRNA转染抑制MCM2表达，肝癌细胞的S期受到阻滞，细胞增殖显著下降，Lable-free定量蛋白质组研究提示MCM2可能通过细胞周期蛋白CDK2/7影响肝癌细胞系增殖。
　　2、通过研究蛋白质组学聚焦肝硬化组织中细胞外基质Extracellularmatrix(ECM)相关蛋白，发现肝硬化新的分子机制并鉴定肝硬化靶向分子CTSS：
　　(1)CTSS在肝硬化组织中显著上调。通过iTRAQ定量蛋白质组学技术分析肝硬化肝组织和正常肝组织，鉴定到组织蛋白酶CTSS在肝硬化组织中上调表达，通过CTSS抗体进行免疫组化染色确认肝硬化组织中CTSS的表达显著高于正常肝组织，且在硬化程度较高的肝硬化组织中表达量较高。
　　(2)根据美国国家生物技术中心(National Center for Biotechnology Information， NCBI)收录的肝硬化和正常肝组织RNAseq数据，CTSS在mRNA水平的表达量与肝硬化分期呈显著正相关。
　　(3)近红外成像提示CTSS在肝硬化组织中表达量升高。使用C57Bl/6j野生型小鼠(wildtype，WT)建立CCl4诱导的肝硬化小鼠模型，合成荧光染料吲哚菁绿(Indocyanine Green，ICG)偶联CTSS抗体复合物ICG-CTSS，并注射到肝硬化模型小鼠和对照组小鼠体内，近红外成像显示在CCl4诱导的小鼠肝脏中出现显著的荧光累积，提示CTSS在肝硬化小鼠肝脏中的表达量升高。
　　(4)CTSS影响肝硬化进展。利用WT鼠和相同遗传背景的CTSS基因敲除鼠(CTSS KO)建立CCl4诱导的肝硬化小鼠模型，根据苏木素伊红(Hematoxylin and eosin staining，HE)染色和Masson染色，CCl4诱导的CTSSKO鼠模型中，纤维间隔变细、胶原沉积减少，肝硬化缓解。因此，CTSS是肝硬化的潜在靶点。
　　(5)通过蛋白质组鉴定CTSS酶切产物。进一步分析肝硬化差异表达蛋白，发现从胶原蛋白上降解的一系列活性肽段，以Endostatin和Canstatin为代表的内源性血管抑制素家族蛋白在肝硬化组织中显著上调。并且Westernblot显示，Endostatin在CCl4诱导的CTSSKO组小鼠中的表达量明显低于WT组小鼠，提示Endostatin可能是CTSS的酶切产物。
　　(6)CTSS可能通过影响血管抑制素蛋白Endostatin使LSEC失窗孔进而加重肝硬化。LSEC血管化即失窗孔，是肝硬化早期的重要病理改变。通过扫描电镜，CCl4诱导的WT小鼠组织中LSEC细胞开放的窗孔显著下降，而CTSSKO后LSEC细胞窗孔能维持开放。并在细胞水平证实重组的Endostatin可抑制LSEC细胞窗孔开放。揭示CTSS通过血管抑制素蛋白Endostatin抑制LSEC细胞窗孔开放而影响肝硬化的潜在分子机制。