HIF-1α调控TGF-β1介导低氧培养的猪肺动脉内皮细胞间质转化

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【目的】观察低氧培养的猪肺动脉内皮细胞在形态和生理特性方面的变化;观察低氧对内皮细胞迁移能力的影响;研究HIF-1α和TGF-β1的关系以及它们在调节猪肺动脉内皮细胞间质转化中的作用。【方法】实验由两部分组成(1)质粒转染前的实验部分:采用酶消化法提取猪原代肺动脉内皮细胞,划痕实验检测低氧环境对内皮细胞迁移能力的影响,设置常氧组作为对照;免疫荧光双标记检测内皮细胞特异性抗原VE-cadherin和间质细胞抗原α-SMA,观察常氧组和低氧组VE-cadherin和α-SMA表达量的变化,计算转化率,进行统计分析; Western blot、RT-PCR等实验检测常氧组和低氧组内皮细胞中HIF-1α、VE-cadherin、TGF-β1和α-SMA的蛋白及mRNΑ表达。(2)细胞质粒转染部分:转染HIF-1α过表达质粒或者干扰质粒,使其过表达或者沉默,Western blot、RT-PCR检测质粒转染后猪肺动脉内皮细胞中VE-cadherin、TGF-β1和α-SMA的蛋白及mRNA表达。【结果】1.转染前的实验:(1)与常氧组比较,低氧组内皮细胞由原来的多角形结构转变成长梭形样结构转变,单层排列的鹅卵石样结构消失;此外,低氧下内皮细胞与细胞间的粘附力减弱,迁移能力增强(P<0.01);(2)免疫荧光结果显示:低氧组内皮间质转化率明显高于常氧组(P<0.01);(3)Western blot结果显示低氧组内皮细胞中,HIF-1α、TGF-β1、α-SMA的蛋白表达高于常氧组(P<0.05),而VE-cadherin在低氧组的表达逐渐下降(P<0.05);(4)RT-PCR结果显示低氧组内皮细胞中,HIF-1α、TGF-β1、α-SMA的mRNA水平高于常氧组(P<0.05),而VE-cadherin的mRNA水平低于常氧组(P<0.05)。2.转染后的实验:(1)HIF-1α过表达质粒成功转染原代猪肺动脉内皮细胞;低氧4天+HIF-1α过表达组细胞中α-SMA的蛋白和mRNA表达水平高于其他三组(P<0.05);VE-cadherin的蛋白和mRNA表达水平低于其他三组(P<0.05)。(2)成功转染HIF-1α干扰质粒;低氧4天+HIF-1α过表达组细胞中α-SMA的蛋白和mRNA水平低于低氧4天+空白质粒组,但仍高于常氧组(P<0.05);VE-cadherin的蛋白和mRNA表达水平高于低氧4天+空白质粒组,但仍低于常氧组(P<0.05)。(3)转染HIF-1α过表达质粒,TGF-β1的蛋白和mRNA水平在低氧4天+HIF-1α过表达组高于其他三组(P<0.05);转染HIF-1α干扰质粒,TGF-β1的蛋白和mRNA表达水平低于低氧4天+空白质粒组(P<0.05),与常氧组比较无差别(P>0.05)。【结论】1.低氧诱导原代培养的猪肺动脉内皮细胞发生形态改变;2.低氧促使原代猪肺动脉内皮细胞的粘附力下降,迁移能力增强,可能是其发生内皮间质转化的机制之一;3.低氧稳定核内的HIF-1α蛋白,HIF-1α上调猪肺动脉内皮细胞中TGF-β1的表达,而TGF-β1介导内皮间质转化过程。
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