论文部分内容阅读
捻转血矛线虫(Haemonchus contortus)属毛圆科(Trichostrongylidae)血矛属(Haemonchus)线虫,是山羊等反刍动物的主要胃肠道寄生虫之一,患病动物通常表现为贫血、消瘦甚至死亡,造成巨大经济损失。目前的主要防治方法是使用化学药物驱虫,但随着抗药性虫株的出现,化学药品治疗正受到严重的挑战,人们正努力寻求通过免疫学的方法,代替化学药物控制该病。目前,捻转血矛线虫免疫学方面的研究已取得了重要进展,但尚无商品化疫苗用于该病的防控。发掘新的抗原、深入研究虫体抗原的特性对其疫苗的研究具有重要意义。本文利用cDNA末端快速扩增(RACE)技术首次克隆出捻转血矛线虫过氧化物酶(Peroxidase,POD)基因的全长cDNA序列,进行了序列和生物特性分析,并对其在各发育阶段的表达情况进行了定量检测；研究了HC58、Dim-1、Actin、H11-2和ES245种蛋白对山羊外周血淋巴细胞的增值效果和对细胞因子表达情况的变化；对这五种蛋白在捻转血矛线虫雌、雄虫中的分布进行了分析。1捻转血矛线虫过氧化物酶基因克隆及其生物信息学分析根据前期蛋白质谱结果,结合Caenorhabditis briggsae、Caenorhabditis remanei和Caenorhabditis elegans三种线虫的过氧化物酶(Peroxidase)基因保守序列设计引物,从捻转血矛线虫cDNA中扩增出550bp的DNA片段,经克隆测序后以此EST为基础,利用5’RACE和3’RACE技术分别获得该基因的5’端和3’端未知序列,将这些序列拼接后获得捻转线虫HcPOD基因的全长cDNA序列(2734bp),序列分析发现,该基因含有一个2466bp的最大开放阅读框(ORF)、28bp5’非翻译区和240bp3’非翻译区。根据此ORF设计1对特异性引物,以捻转血矛线虫的cDNA为模板,采用RT-PCR技术,扩增出2451bp的DNA片段,与推导的ORF长度一致,二者序列相似性为98%。利用DNAstar软件,结合网络资源对其分析,发现该基因编码816个氨基酸,推测蛋白的等电点为9.565,分子质量91.8kDa。有多个潜在的生物活性功能位点,蛋白的理化性质稳定。2捻转血矛线虫HcPOD、HC58、Dim-1、Actin、H11和ES24基因阶段性表达特性分析根据本实验室克隆到的捻转血矛线虫的POD、Hc58、Dim-1、Actin、Hll和ES24基因全长序列,设计荧光定量PCR引物。以β-Tubulin基因为内参,对所设计引物的扩增效率进行验证,筛选符合要求的引物,进一步对其在捻转血矛线虫的虫卵期,第三期幼虫,雌虫和雄虫中表达情况进行定量分析。结果显示5种基因在雄虫中表达量显著高于其他3个发育时期；在第三期幼虫中的表达量,除HC58基因是雌虫的1.59倍外,其他5种基因的表达量均比较低；而在虫卵中的表达量,HC58基因最高约为雌虫的7.66倍,Actin基因的最低约为雌虫的0.15倍。3捻转血矛线虫HC58、Dim-1、Actin、H11-2和ES24重组蛋白对山羊外周血淋巴细胞细胞因子表达情况影响根据GenBank中已知的山羊IL-2、 IL-4、 IL-10、 IL-17、 IFN-y、 TGF-p的序列设计荧光定量引物,以β-Actin基因为内参,对所设计引物的扩增效率进行验证,筛选符合要求的引物。用HC58、 Dim-1、 Actin、H11-2和ES24重组蛋白分别分梯度刺激的淋巴细胞cDNA为模板,进行荧光定量试验,以检测细胞因子的表达情况。结果显示,和对照组(空pET28a蛋白组)相比,细胞因子IL-2在HC58(20μg/mL)组表达量极显著高于对照组(p<0.01); Dim-1(40μg/mL)、Actin(40μg/mL)和ES24(40μg/mL)组的IL-2表达量均极显著高于对照组(p<0.01)；H11-2的两个高浓度组的表达量都比对照组高(p<0.01)。HC58(10μg/mL)、Dim-1(10μg/mL)、Actin (20μg/mL)和ES24(20μg/mL)组IL-4表达量均明显高于对照组(p<0.05); Dim-1(40μg/mL)和H11-2(40μg/mL)组的表达量极显著高于对照组(p<0.01)。HC58(10μg/mL)和ES24(10μg/mL)组有显著下调IL-10的作用(p<0.05),而H11-2(20μg/mL)组极显著下调的了IL-10的表达量(p<0.01); HC58(20μg/mL)、HC58(40μg/mL) Dim-1(40μg/mL)和Actin (40μg/mL)组IL-10表达量极显著高于对照组(p<0.01)Actin (40μg/mL)组的误差比较大。IL-17在Actin (20μg/mL)组的表达量显著高于对照组(p<0.05),其他的除每种蛋白的0μg/mL组、ES24(10μg/mL)组和ES24(20μg/mL)组外,IL-17的表达量均极显著高于对照组(p<0.01)。HC58(20、40μg/mL)、 Dim-1(20、40μg/mL)、H11-2(10、20、40μg/mL)和Actin (10、20、40μg/mL)组IFN-y表达量极显著高于对照组(p<0.01); IFN-y在ES24(20μg/mL)组的表达量明显高于对照组(p<0.05)。除Actin (40μg/mL)和ES24(20μg/mL) TGF-β的表达量显著高于对照组外,其他组TGF-p的变化不明显。4捻转血矛线虫HC58、Dim-1、Actin、H11-2和ES24重组蛋白对山羊外周血淋巴细胞的增殖作用为检测重组蛋白HC58、Dim-1、Actin、H11-2和ES24对山羊外周血淋巴细胞的刺激与增殖作用,将这5种重组蛋白与山羊外周血淋巴细胞共培养,用CCK-8法检测其增殖效果。结果发现HC58在浓度为20μg/mL时有明显的增殖效果(p<0.05)H11-2在添加浓度为10μg/mL和20μg/mL时增殖效果显著(p<0.05),Actin和ES24分别在40μg/mL和20μg/mL时有极显著的增殖效果(p<0.01)。结果说明HC58、Actin、Dim-1、H11-2和ES24均有促山羊外周血淋巴细胞增殖的效应。5HC58、Dim-1、Actin、H11和ES24蛋白在捻转血矛线虫雌、雄成虫中的定位为了研究捻转血矛线虫HC58、Dim-1、Actin、H11、ES24五种蛋白在虫体中的分布与定位情况,我们用SD大鼠制备抗血清,应用即用型SABC免疫组化染色试剂盒检测五种抗原在捻转血矛线虫雌、雄虫中的分布。结果发现,五种蛋白在肠道上均有定位,HC58在雌虫中主要集中肠壁上,在雄虫中除性腺外其他组织也可以看到,但蛋白丰度不如肠道位置高；Actin主要位于雌、雄虫的肠道上,其他的管道也有微弱表达；Dim-1在雌虫虫体的肠壁上有大量表达,而在雄虫肠道中的表达量不如雌虫高；ES24在雌雄虫体内的表达部位较广,除性腺部位外,其他位置均表达,但表达量都不如肠道中的高；蛋白H11位置很单一,只在肠道中表达。