电化学传感器用于乙型肝炎病毒快速分型的实验研究

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乙型肝炎是由乙型肝炎病毒(hepatitis B virus, HBV)感染引起的常见传染病,严重影响人类健康。在我国,乙型肝炎的发生率很高,目前乙型肝炎的预防和控制形势并不乐观。乙型肝炎病毒基因容易突变,在我国,乙型肝炎病毒基因主要以B型和C型为主。乙型肝炎病毒基因的类型与病毒复制、突变、肝病的严重程度、HBV感染后的慢性进展以及抗病毒药物疗效等密切相关。大量的研究表明,感染B型HBV的患者相对C型感染者有更好的临床转归。因此,准确、快速的HBV分型对于HBV感染进展风险的预测和合适治疗方案的选择具有重要的意义。本文利用DNA电化学生物传感器技术构建了两种用于乙型肝炎病毒基因B、C分型(B型、C型和B、C混合型)检测的新方法。  本文第一部分通过Au-S键将巯基修饰的B1、B2、C1和C2四支特异性分型探针(每一基因型均设计双探针形成双重验证体系)分别固定在1、2、3和4号金电极表面,检测杂交前后与DNA骨架中带负电的磷酸基团结合的RuHex产生的电化学信号差异。与B基因型杂交时,1和2号电极电量均显著增加,而3和4号电极电量无明显变化;与C基因型杂交时,3和4号电极电量均显著增加,而1和2号电极信号不变;与BC混合基因型杂交时,4支电极电量均增加。其检测的浓度范围为10-10~10-7 M。  本文的第二部分利用两种不同短核苷酸序列最佳杂交温度的显著差异构建了一种双探针基因分型传感器。双探针中的一个探针是来自于B型乙肝病毒的特异性核苷酸序列,其在59℃时杂交效率最大,而另外一个探针是来自于C型乙肝病毒的特异性核苷酸序列,其最适杂交温度为43℃,在59℃时则发生了较大程度上的解链。根据这种现象,首先,我们把双探针组装的金电极与加有C型信号链的样品溶液于43℃杂交后进行第一次测量,经过简单的洗涤之后,再把此电极放在另一加有B型信号链的样品溶液中于59℃进行二次杂交与二次测量。根据两次测量结果之间的关系来确定基因型:第二次测量结果显著大于第一次测量结果的为B型,第二次测量结果显著小于第一次测量结果的为C型,第二次测量结果与第一次测量结果相近的则为B、C混合型。
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