早产儿与足月儿脐血间充质干细胞体外分离、培养及鉴定

来源 :广州医学院 广州医科大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:steve0309
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【目的】观察分析早产儿与足月儿脐血间充质干细胞分离培养成功率,并研究其相关生物学特性和诱导分化潜能,寻求脐血间充质干细胞获取的最佳途径,为其进一步实验研究提供理论依据。【方法】无菌条件下共取52份脐血,其中32份为足月儿脐血,20份为早产儿脐血(孕周32~36周),枸橼酸钠抗凝。取12份足月儿脐血,采用Ficoll淋巴细胞分离分离液密度梯度离心获取单核细胞(MNCs),同等接种密度下对比DMEM/F12培养基和MesencultTM培养基对脐血间充质干细胞培养成功率的影响;取20份足月儿脐血,密度梯度离心法获取MNCs,采用MesencultTM培养基,分别以1×106/ml,1×107/ml密度接种,对比两种接种密度对脐血间充质干细胞培养成功率的影响;取20份早产儿脐血,以1×107/ml密度接种于MesencultTM培养基,对比早产儿与足月儿脐血间充质干细胞培养成功率,并研究其各自生物学特性及诱导分化潜能。通过倒置显微镜观察其形态、生长增殖情况并描绘细胞生长曲线;流式细胞仪检测细胞表面标记,包括CD29、CD44、CD105、CD34、CD45;分别用成骨细胞、成脂细胞和成软骨细胞完全培养基进行诱导分化,通过茜红素染色检测间充质干细胞向成骨细胞诱导分化的能力,油红O染色检测其向脂肪细胞分化能力,阿利新蓝染色检测其向软骨细胞分化能力。采用SPSS13.0统计软件进行数据统计分析。【结果】1.采用MesencultTM培养基和DMEM/F12培养基,1×107/ml接种密度和1×106/ml接种密度培养脐血间充质干细胞成功率的比较采用MesencultTM和DMEM/F12培养基,其他条件等同的情况下,间充质干细胞培养成功率分别为50.00%(6/12)和8.33%(1/12),差异有统计学意义(P<0.05);采用1×107/ml和1×106/ml接种密度,其他条件等同的情况下,间充质干细胞培养成功率分别为55.00%(11/20)和20.00%(4/20),差异有统计学意义(P<0.05)。2.早产儿与足月儿脐血间充质干细胞培养成功率的比较采用MesencultTM培养基及1×107/ml接种密度,其他条件相同,早产儿与足月儿脐血间充质干细胞培养成功率分别为85.00%(17/20)和55.00%(11/20),差异有统计学意义(P<0.05)。3.早产儿与足月儿脐血间充质干细胞生物学特性的比较3.1早产儿与足月儿脐血间充质干细胞原代培养时间分别为(19.65±1.69 )d和(28.36±1.36)d,差异有统计学意义(P<0.05);P4代早产儿与足月儿脐血MSCs传代培养时间分别为(14.94±1.75)d和(19.27±2.10)d,差异有统计学意义(P<0.05)。3.2流式细胞仪检测显示,早产儿与足月儿脐血MSCs均表达典型间充质干细胞标记CD29、CD44和CD105,均不表达造血干细胞标记CD34和CD45。4.早产儿与足月儿脐血间充质干细胞诱导分化潜能的比较早产儿与足月儿脐血间充质干细胞成骨细胞诱导2周行茜素红染色均可见胞浆中有大量红色钙化基质沉积;成脂肪细胞诱导3周时行油红O染色均可见胞质中的脂滴被染成红色;成软骨细胞诱导3周时行阿利新蓝染色均可见细胞微团中有淡蓝色酸性蛋白多糖。早产儿与足月儿脐血间充质干细胞均具有向成骨细胞、成脂细胞及成软骨细胞分化潜能。【结论】1.早产儿与足月儿脐血中均存在间充质干细胞,并可在体外分离、纯化与扩增。2.采用MesencultTM培养基和1×107/ml接种密度更有利于提高脐血间充质干细胞的培养成功率。3.早产儿较足月儿脐血间充质干细胞培养成功率更高,原代和传代培养时间更短。4.早产儿与足月儿脐血间充质干细胞均可在体外诱导分化为成骨细胞、成脂细胞和成软骨细胞。
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