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摘要[目的]了解柿树内生细菌的多样性及分布规律。[方法]采用平板分离法对柿树内生细菌进行首次分离、筛选和鉴定。[结果]从柿树根、幼茎和叶中共分离出内生细菌11株，不同组织中内生细菌的数量存在差异；经菌落形态特征和显微形态观察鉴定分属于4个属，即短小杆菌属（Curtobacterium）1株、芽孢杆菌属（Bacillus）7株、乳杆菌属（Lactobacillus）1株、假单胞菌属（Pseudomonas）2株。[结论]柿树内生细菌具有生物多样性。
关键词柿树；内生细菌；鉴定
中图分类号S432.4+2文献标识码A文章编号0517-6611（2014）24-08175-02
Isolation and Identification of Entophytic Bacteria from Diospyros kaki Thunb
WANG Gengxian et al（School of Life Science and Engineering， Handan College， Handan， Hebei 056005）
Abstract[Objective] The aim was to understand the biological diversity and distribution law of entophytic bacteria from persimmon. [Method] The entophytic bacteria of persimmon were primarily isolated， screened and identified by using plateisolating method. [Result] Eleven strains of entophytic bacteria were isolated from the roots， young stems and leaves of persimmon using the streak plate method. The population densities varied with tissues of the plant. Through the morphology of the colony and microscopic identification， they belonged to four genera， including Curtobacterium （one strain）， Bacillus （seven strains）， Lactobacillus （one strain） and Pseudomonas （two strains）. [Conclusoion] The entophytic bacteria of persimmon have biological diversity.
Key wordsDiospyros kaki Thunb； Entophytic bacteria； Identification
植物内生细菌泛指那些在其生活史的某一阶段生活在植物组织内但不引起植物组织明显病害症状的一类微生物[1]。近年来，关于植物内生细菌应用于植物病害防治方面的研究越来越多，目前已成为植物病害生物防治的主要药源之一，具有较高的理论研究价值和实际应用价值[2]。研究表明，几乎所有的植物体内都含有内生细菌，并产生内生细菌和其宿主植物长期共存的现象。内生细菌对寄主植物有促生、防病、内生固氮等广泛的生物学作用[3-4]。
柿树在全国各地广为栽培，是古老的栽培果树之一，也是我国重要的经济果树之一[5]。在柿树的生长过程中常受到多种病原菌的危害，目前我国柿树病害已知有16种，其中以角斑病、圆斑病和炭疽病发生较普遍且严重，给柿子的生产带来巨大的经济损失[6]。目前的防治手段主要以化学农药为主，但长期使用农药不仅影响柿子的品质，还会给环境带来危害，所以探寻生物防治的途径势在必行。为此，笔者对柿树内生细菌进行了首次分离、筛选和鉴定，初步研究了柿树内生细菌的多样性及分布规律，旨在为今后柿树微生物防治和内生细菌资源的开发奠定基础。
1材料与方法
1.1材料
1.1.1供试品种。供试柿树品种为磨盘柿（Diospyros kaki L.f.constricta），于2013年5月采自邯郸学院校园内。采集健康植株的根、幼茎、叶供试验用。
1.1.2培养基。分离培养基为营养琼脂（NA）：牛肉膏 3 g，蛋白胨 10 g，NaCl 5 g，琼脂 20 g，蒸馏水 1 000 ml，pH 6.5～7.5。
1.2方法
1.2.1内生细菌的分离和测数。参考饶小莉等[7]的方法，取经表面灭菌彻底的材料1.00 g于无菌研钵中研磨，将研磨的组织加到含0.85%灭菌生理盐水的锥形瓶中，旋窝振荡1 min，将上清液倒入灭菌的离心管中沉淀，吸取1.0 ml上清液做梯度稀释，分别取0.1 ml稀释液涂布NA平板，每个稀释浓度3次重复，置于37 ℃恒温箱培养，3～5 d后计菌落数。根据菌落的形态、颜色、大小等挑取单菌落，反复划线纯化后接斜面保存，供测试鉴定。
1.2.2内生细菌的鉴定。分离细菌菌株的鉴定主要参考《一般细菌常用鉴定方法》[8]和《常见细菌系统鉴定手册》[9]，测定菌株的形态、培养性状和生理生化特性。
2结果与分析
43讨论
该研究虽然发现柿树根、幼茎、叶3种器官中存在不同种类的内生细菌，但是提取到的菌株种类与其他研究报道的数10种甚至近百种仍相差很远。虽然其原因不排除柿树本身含有的内生细菌种类较少，但是可能与试验中选用的材料为生长年份较少的柿树有关，幼嫩组织分裂生长很快导致其内生细菌的含量相对较低。此外，分离内生细菌时采用组织块分离法，导致非切口处组织的内生细菌很难被提取出来，而将组织研磨破碎得到提取液涂布培养可能会使之得以改善。
植物各种组织内生细菌种类存在差异可能是因为不同器官的结构不同，各器官所处微环境（如通气、营养、细胞理化环境等）不同。因此，有必要对内生细菌的侵染机理进行研究，以便更好地探究柿樹内生细菌种群分布规律，为今后进一步研究柿树内生细菌提供依据。该研究为进一步研究内生细菌对柿树的作用奠定了基础，不仅使人们对柿树各组织、器官内可能含有的内生细菌有所了解，而且为柿树病害的防治提供了新思路。
参考文献
[1] 张祺玲，杨宇红，谭周进，等.植物内生菌的功能研究进展[J].生物技术通报，2010（7）：37-44.
[2] 闫孟红，蔡正求，韩继光，等.植物内生细菌在防治植物病害中的应用现状[J].生物技术通报，2004，30（3）：8-12.
[3] 杨海莲，孙晓璐，送未，等.植物内生细菌的研究[J].微生物学通报，1998，25（4）：224-226.
[4] 罗永兰，张志远，喻珺.柑橘内生细菌的分离与鉴定[J].湖北农业科学，2006，45（6）：773-775.
[5] 胡青素，龚榜初，谭晓风，等.柿子的应用价值及发展前景[J].湖南农业科学，2010（1）：103-106.
[6] 郭昌贤.柿树病害的症状与防治[J].安徽农学通报，2008，14（1）：12-13.
[7] 饶小莉，沈德龙，李俊，等.甘草内生细菌的分离及拮抗菌株鉴定[J].微生物学通报，2007（4）：117-123.
[8] 中国科学院微生物所细菌分类组.一般细菌常用鉴定方法[M].北京：科学出版社，1978.
[9] 东秀珠，蔡妙英.常见细菌系统鉴定手册[K].北京：科学出版社，2001.
关键词柿树；内生细菌；鉴定
中图分类号S432.4+2文献标识码A文章编号0517-6611（2014）24-08175-02
Isolation and Identification of Entophytic Bacteria from Diospyros kaki Thunb
WANG Gengxian et al（School of Life Science and Engineering， Handan College， Handan， Hebei 056005）
Abstract[Objective] The aim was to understand the biological diversity and distribution law of entophytic bacteria from persimmon. [Method] The entophytic bacteria of persimmon were primarily isolated， screened and identified by using plateisolating method. [Result] Eleven strains of entophytic bacteria were isolated from the roots， young stems and leaves of persimmon using the streak plate method. The population densities varied with tissues of the plant. Through the morphology of the colony and microscopic identification， they belonged to four genera， including Curtobacterium （one strain）， Bacillus （seven strains）， Lactobacillus （one strain） and Pseudomonas （two strains）. [Conclusoion] The entophytic bacteria of persimmon have biological diversity.
Key wordsDiospyros kaki Thunb； Entophytic bacteria； Identification
植物内生细菌泛指那些在其生活史的某一阶段生活在植物组织内但不引起植物组织明显病害症状的一类微生物[1]。近年来，关于植物内生细菌应用于植物病害防治方面的研究越来越多，目前已成为植物病害生物防治的主要药源之一，具有较高的理论研究价值和实际应用价值[2]。研究表明，几乎所有的植物体内都含有内生细菌，并产生内生细菌和其宿主植物长期共存的现象。内生细菌对寄主植物有促生、防病、内生固氮等广泛的生物学作用[3-4]。
柿树在全国各地广为栽培，是古老的栽培果树之一，也是我国重要的经济果树之一[5]。在柿树的生长过程中常受到多种病原菌的危害，目前我国柿树病害已知有16种，其中以角斑病、圆斑病和炭疽病发生较普遍且严重，给柿子的生产带来巨大的经济损失[6]。目前的防治手段主要以化学农药为主，但长期使用农药不仅影响柿子的品质，还会给环境带来危害，所以探寻生物防治的途径势在必行。为此，笔者对柿树内生细菌进行了首次分离、筛选和鉴定，初步研究了柿树内生细菌的多样性及分布规律，旨在为今后柿树微生物防治和内生细菌资源的开发奠定基础。
1材料与方法
1.1材料
1.1.1供试品种。供试柿树品种为磨盘柿（Diospyros kaki L.f.constricta），于2013年5月采自邯郸学院校园内。采集健康植株的根、幼茎、叶供试验用。
1.1.2培养基。分离培养基为营养琼脂（NA）：牛肉膏 3 g，蛋白胨 10 g，NaCl 5 g，琼脂 20 g，蒸馏水 1 000 ml，pH 6.5～7.5。
1.2方法
1.2.1内生细菌的分离和测数。参考饶小莉等[7]的方法，取经表面灭菌彻底的材料1.00 g于无菌研钵中研磨，将研磨的组织加到含0.85%灭菌生理盐水的锥形瓶中，旋窝振荡1 min，将上清液倒入灭菌的离心管中沉淀，吸取1.0 ml上清液做梯度稀释，分别取0.1 ml稀释液涂布NA平板，每个稀释浓度3次重复，置于37 ℃恒温箱培养，3～5 d后计菌落数。根据菌落的形态、颜色、大小等挑取单菌落，反复划线纯化后接斜面保存，供测试鉴定。
1.2.2内生细菌的鉴定。分离细菌菌株的鉴定主要参考《一般细菌常用鉴定方法》[8]和《常见细菌系统鉴定手册》[9]，测定菌株的形态、培养性状和生理生化特性。
2结果与分析
43讨论
该研究虽然发现柿树根、幼茎、叶3种器官中存在不同种类的内生细菌，但是提取到的菌株种类与其他研究报道的数10种甚至近百种仍相差很远。虽然其原因不排除柿树本身含有的内生细菌种类较少，但是可能与试验中选用的材料为生长年份较少的柿树有关，幼嫩组织分裂生长很快导致其内生细菌的含量相对较低。此外，分离内生细菌时采用组织块分离法，导致非切口处组织的内生细菌很难被提取出来，而将组织研磨破碎得到提取液涂布培养可能会使之得以改善。
植物各种组织内生细菌种类存在差异可能是因为不同器官的结构不同，各器官所处微环境（如通气、营养、细胞理化环境等）不同。因此，有必要对内生细菌的侵染机理进行研究，以便更好地探究柿樹内生细菌种群分布规律，为今后进一步研究柿树内生细菌提供依据。该研究为进一步研究内生细菌对柿树的作用奠定了基础，不仅使人们对柿树各组织、器官内可能含有的内生细菌有所了解，而且为柿树病害的防治提供了新思路。
参考文献
[1] 张祺玲，杨宇红，谭周进，等.植物内生菌的功能研究进展[J].生物技术通报，2010（7）：37-44.
[2] 闫孟红，蔡正求，韩继光，等.植物内生细菌在防治植物病害中的应用现状[J].生物技术通报，2004，30（3）：8-12.
[3] 杨海莲，孙晓璐，送未，等.植物内生细菌的研究[J].微生物学通报，1998，25（4）：224-226.
[4] 罗永兰，张志远，喻珺.柑橘内生细菌的分离与鉴定[J].湖北农业科学，2006，45（6）：773-775.
[5] 胡青素，龚榜初，谭晓风，等.柿子的应用价值及发展前景[J].湖南农业科学，2010（1）：103-106.
[6] 郭昌贤.柿树病害的症状与防治[J].安徽农学通报，2008，14（1）：12-13.
[7] 饶小莉，沈德龙，李俊，等.甘草内生细菌的分离及拮抗菌株鉴定[J].微生物学通报，2007（4）：117-123.
[8] 中国科学院微生物所细菌分类组.一般细菌常用鉴定方法[M].北京：科学出版社，1978.
[9] 东秀珠，蔡妙英.常见细菌系统鉴定手册[K].北京：科学出版社，2001.