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【摘要】 目的：观察中枢八肽胆囊收缩素（CCK-8）对局部脑缺血再灌注诱导的大鼠海马神经元凋亡及凋亡相关基因（bax; bcl-2; p53; Caspase-3）表达的影响。方法：将大鼠随机分为假手术组（Sham）、局部脑缺血再灌注组（I/R）、不同剂量CCK-8（0.5μg、1.0μg、2.0μg、4.0 μg）+I/R组，采用线栓法建立大鼠局部脑缺血再灌注模型，CCK-8给药采用侧脑室注射技术。各组动物均于脑缺血1h再灌注24h后断头取脑。应用脱氧核苷酸末端转移酶介导的原位末端标记(TUNEL)技术和流式细胞术检测大鼠神经元凋亡情况，荧光定量PCR和Western blot方法测定各组神经组织中凋亡相关基因mRNA和蛋白的表达。结果：局部脑I/R组大鼠神经元凋亡率较Sham组明显增加，注射1.0μg和2.0μg 的CCK-8可显著降低神经元凋亡率(P<0.01)；与Sham组相比，I/R组脑组织bax mRNA和蛋白表达增加，而bcl-2 mRNA和蛋白表达减少，1.0μg和2.0μg CCK-8可降低缺血再灌注引起的大鼠bax mRNA和蛋白表达，而增加bcl-2 mRNA和蛋白表达；与Sham组相比，局部脑I/R组大鼠Caspase-3蛋白表达增加，1.0μg和2.0μg CCK-8可降低Caspase-3蛋白表达。结论：CCK-8可抑制局部脑缺血再灌注诱导的神经元凋亡，抑制凋亡的机制可能与其改变凋亡相关基因的表达有关。
【关键词】 八肽胆囊收缩素；脑缺血/再灌注；凋亡
神经细胞凋亡是造成脑缺血再灌注后神经功能缺损的重要机制之一。细胞凋亡基因p53、Bcl-2、Bax以及Caspase-3在细胞凋亡中起着重要作用。胆囊收缩素(cholecystokinin，CCK)是脑组织中含量最丰富的神经肽之一，硫酸化的八肽胆囊收缩素(CCK-8)是具有CCK完全生物活性的最小片段，是CCK在脑中的主要存在形式，在脑中以神经递质或调质的形式参与多种生理及病理过程。已有研究证实，CCK-8具有减轻局部脑缺血再灌注损伤的作用，其机制可能与抑制自由基损伤及增加局部脑血流量有关。但CCK-8对脑缺血再灌注诱导的神经元凋亡有无影响尚未见报道。本文观察CCK-8对大鼠脑缺血再灌注诱导的神经元凋亡及其基因表达变化的影响，并探讨其可能的分子生物学机制。
1 材料与方法
1.1 材料 健康雄性Wistar大鼠36只，体重250~300 g，由河北省实验动物中心提供。硫酸化CCK-8购自美国Sigma公司；原位凋亡检测试剂盒购自华美生物公司；Trizol、dNTP、MMLV逆转录酶、Taq DNA聚合酶、oligo(dT)和TaqMan荧光探针购自Promega (Madison)。荧光定量PCR的引物由北京赛百盛公司合成，探针标记5′端FAM, 3′端TAMRA。兔抗鼠Bcl-2、Bax、β-actin、小鼠抗大鼠Caspase-3单克隆抗体均为Santa公司的产品。
1.2 方法
1.2.1 大鼠局部腦缺血/再灌注模型的制备 用自制尼龙丝线烧灼器将一长40 mm、直径0.25 mm 的尼龙丝线一端烧熔为直径约0.33 mm的光滑球端，然后将此尼龙线用75%酒精擦洗干净，在距球端18.5 mm处做标记，置0.9% 的无菌生理盐水中备用。将大鼠用10%水合氯醛生理盐水溶液麻醉（350mg/kg, ip），仰卧于手术台上，行尾动脉插管，用多道生理记录仪监测尾动脉血压、心率。颈正中切开皮肤，分离左侧颈外动脉(ECA) 、颈内动脉(ICA)，在ECA远心端结扎并离断，在 ECA 剪一小口注入60U肝素钠生理盐水溶液0.1ml后，将尼龙丝线由此切口插入ICA ，插入18.5±0.5mm左右阻断大脑中动脉（MCA）的血液供应，脑缺血1h后，将尼龙丝线轻轻向外拔，退至ECA残端恢复再灌注。动物苏醒后，返回鼠笼，于再灌注24h处死动物。 假手术对照组除不插尼龙丝线外，其它步骤同上。手术过程中，监测直肠温度，并保持在36.5℃~37.5℃。
1.2.2 侧脑室注射 脑室注射药物均以人工脑脊液作溶剂(artificial cerebrospinal fluid，ACSF，pH 7.4，浓度mmol/L：NaCl130，KCl 2.99，CaCl2 0.98，MgCl 2·6H2O 0.80，NaHCO3 25，Na2HPO4·12H2O 0.039，NaH2PO4·2H2O 0.46)。将麻醉大鼠固定于动物大脑定位仪(DGY-79A型，吉林省长春锻压设备厂)，切开额顶叶头皮，暴露前囟点。侧脑室坐标为：前囟点后0.8 mm，左旁开1.5 mm，硬膜下3.7 mm，根据坐标在顶骨上钻一直径0.5 mm的小孔，用10μL微量注射器吸取5μL药液，于1 min内匀速注入并留针2 min。
1.2.3 实验分组 动物随机分为3组：(1)假手术组(Sham)：无脑缺血，侧脑室穿刺后注射5μL的ACSF；(2)缺血/再灌注组(I/R)：夹闭颈总动脉前15min侧脑室注射5μL的ACSF；(3) CCK-8组+缺血/再灌注(CCK-8+I/R)：夹闭颈总动脉前15min侧脑室注射以5μL ACSF溶解的CCK-8（0.5μg、1.0μg、2.0μg、4.0 μg）。各组动物均于脑缺血2 h再灌注24 h 断头取脑。
1.2.4 脱氧核苷酸末端转移酶介导的DNA原位末端标记技术(TUNEL)检测海马神经元凋亡 将大鼠麻醉，开胸经升主动脉插管，依次灌注生理盐水和10g/L的甲醛各200ml断头取脑，取缺血侧半暗区脑组织置于同一甲醛溶液中固定3d，石蜡包埋。连续冠状切片，片厚5μm。应用原位凋亡检测试剂盒检测神经元的凋亡，严格按试剂盒说明书进行操作。阳性细胞核染成棕黄色，边界清楚。凋亡细胞计数时，每张切片在高倍镜下(400×)随机计数海马CA1区1 mm区段TUNUL阳性细胞数目，取平均值。
1.2.5 流式细胞术检测神经元凋亡率 再灌注24 h，各组随机取10只大鼠，断头取脑，在冰盘上快速分离出左侧大脑半暗区脑组织后放入70%乙醇溶液中固定，4℃保存。制备细胞混悬液，将混悬液用300目铜网过滤去除细胞团块，将细胞悬液离心2 min(500~800r/min)。取1×105细胞(0.1 ml)加入溴化乙锭(ethidium bromide，EB)染液1 ml，在4℃避光条件下进行DNA染色30min，流式细胞仪进行单参数检测。检测前以鸡血红细胞作为标准样品，调整仪器的变异系数(CV)在5%以内，测量数据输入HP-Consort30计算机，应用single histogram statistics软件进行处理并打印出结果。
1.2.6 凋亡相关基因检测 对凋亡相关基因（bax; bcl-2）mRNA检测采用荧光定量RT-PCR方法测定。Trizol提取左侧大脑半暗区脑组织中的总RNA，oligo d(T)18和M-MLV逆转录酶将RNA转录到cDNA，PCR反应体系50μL包括5μL10×PCR buffer，5μL cDNA模板或标准品DNA, 4μL 2.5 mmol/LdNTPs，5 U Taq DNA聚合酶, 1μL ROX ( Invitro-gen, Ca.t No. 12223-012), 15 pmol引物和10 pmol TaqMan探针，其中bax、bcl-2和β-actin的引物及探针由北京赛百盛公司合成，标准品由中心实验室提供。反应体系在ABI PRISM 7300仪器完成。反应条件为95℃预变性5 min，然后95℃15 s，60℃1 min共40个循环。Bax、bcl-2结果由β-actin校正。
1.2.7 Western blot分析 左侧大脑皮层及海马半暗区脑组织称重，加入组织裂解液(10% W/V)(50 mM Tris、150 mM NaCl、1% TritonX-100、0.5% 脫氧胆酸钠、1 mM PMSF、0.1% SDS、10 mM NaF、1mM钒酸钠、40 ?g/ml蛋白酶抑制剂混合物)于4℃下匀浆，4℃，12 000 g离心10 min，吸取上清，以考马斯亮蓝G250法进行蛋白定量后将制备好的蛋白样品置-80℃冰箱保存备用。各组取50 ?g样品蛋白行12% SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(100 V，3h)后转入硝酸纤维素膜。应用3%脱脂奶粉(PBS稀释，pH 7.4)室温封闭硝酸纤维素膜1h，分别加入bax、bcl-2、Caspase-3与β-actin一抗溶于0.5%抗体稀释液中(以1: 1000的比例稀释)，4℃密封过夜。TPBS振荡洗膜后，应用辣根过氧化物酶标记的二抗及DAB显色试剂盒进行检测，以出现棕黄色条带为阳性结果。用GDS凝胶图像处理系统分别分析bax、bcl-2和Caspase-3蛋白条带的IOD值和β-actin蛋白的IOD值，以bax、bcl-2、Caspase-3与β-actin蛋白的IOD比值分别代表bax、bcl-2和Caspase-3蛋白的相对表达量。
1.3 统计学方法 数据用均数±标准差(ｘ±s )表示，用SPSS 11.5软件进行统计分析。组间差异用单因素方差分析（one-way ANOVA），有显著差异者用Student-Newmen-Kuels q检验进行两两比较。
2 结果
2.1 海马神经元凋亡数目的变化
TUNEL染色显示，sham组偶有TUNEL阳性细胞，阳性细胞数为2±1.6。缺血再灌注组CA1区可见大量棕黄色着色的TUNEL阳性细胞，与sham组相比，TUNEL阳性细胞数量明显增加（P<0.01）。在CCK-8（1.0μg和2.0μg）处理组，TUNEL阳性神经元数与脑缺血组相比明显减少（P均<0.05）。
2.2 神经元凋亡率的变化
流式细胞术结果显示，假手术组神经元凋亡率较低，缺血再灌注组半暗区脑组织神经元凋亡率明显增高；CCK-8（1.0μg和2.0μg）处理可明显降低神经元凋亡率(表1)。
2.3 凋亡相关基因（bax; bcl-2）mRNA和蛋白表达的变化
与Sham组相比，缺血/再灌注组大鼠脑组织中bax mRNA和蛋白表达增加，而bcl-2 mRNA和蛋白表达减少，1.0μg和2.0μg CCK-8可降低局部脑I/R引起的大鼠脑组织中p53 和 bax mRNA和蛋白表达，而增加bcl-2 mRNA和蛋白表达。
2.4 Caspase-3蛋白表达的变化
与Sham组相比，局部脑I/R组大鼠Caspase-3蛋白表达增加，1.0μg和2.0μg CCK-8可降低Caspase-3蛋白表达。
3 讨论
缺血再灌注损伤是一个复杂的病理生理过程，最终引发缺血级联反应，导致神经元死亡。在脑缺血急性期，细胞凋亡主要出现在缺血半暗带区。本组实验中缺血再灌注24 h后，大鼠缺血半暗带区出现大量的TUNEL阳性细胞。这与相关报道的大鼠缺血再灌注损伤后细胞凋亡的规律相符合。
细胞凋亡的发生取决于促凋亡蛋白和抑凋亡蛋白浓度。目前研究发现，脑缺血神经元凋亡受多种基因调控。Bcl-2是典型的抑凋亡蛋白，而Bax则诱导细胞凋亡。本实验中，假手术组脑组织Bcl-2和Bax只有少量表达，而缺血1h再灌注24h后大鼠缺血侧半暗带脑组织中Bcl-2明显减少而Bax表达明显增多，Caspase-3蛋白表达显著增多。结果提示再灌注后缺血半暗带细胞凋亡反应增加，这与TUNEL阳性神经元数目和神经元细胞凋亡率改变一致。
CCK及其受体广泛存在于脑组织中，近年的研究报道，实验动物局部脑缺血前、后给予CCK-8均可改善血液循环障碍，从而减轻脑组织损伤，但其保护作用是否与抑制神经元凋亡有关尚不清楚。本研究发现，预先给予外源性CCK-8可明显抑制缺血再灌注所致的海马神经元凋亡，同时CCK-8可上调凋亡抑制因子Bcl-2，下调凋亡诱导因子Bax mRNA和蛋白表达，减少Caspase-3蛋白表达。结果证明，缺血再灌注损伤发生时，CCK-8通过调控凋亡相关基因的表达减轻神经细胞凋亡反应的发生，发挥脑保护作用。另外本实验发现，CCK-8抗脑缺血再灌注损伤的作用具有双相性和剂量相关性：小剂量时(如≤1μg)，可剂量依赖地抑制局部脑缺血再灌注大鼠大脑神经元细胞凋亡；剂量超过1μg时，这种保护作用则呈剂量依赖地减弱。
【关键词】 八肽胆囊收缩素；脑缺血/再灌注；凋亡
神经细胞凋亡是造成脑缺血再灌注后神经功能缺损的重要机制之一。细胞凋亡基因p53、Bcl-2、Bax以及Caspase-3在细胞凋亡中起着重要作用。胆囊收缩素(cholecystokinin，CCK)是脑组织中含量最丰富的神经肽之一，硫酸化的八肽胆囊收缩素(CCK-8)是具有CCK完全生物活性的最小片段，是CCK在脑中的主要存在形式，在脑中以神经递质或调质的形式参与多种生理及病理过程。已有研究证实，CCK-8具有减轻局部脑缺血再灌注损伤的作用，其机制可能与抑制自由基损伤及增加局部脑血流量有关。但CCK-8对脑缺血再灌注诱导的神经元凋亡有无影响尚未见报道。本文观察CCK-8对大鼠脑缺血再灌注诱导的神经元凋亡及其基因表达变化的影响，并探讨其可能的分子生物学机制。
1 材料与方法
1.1 材料 健康雄性Wistar大鼠36只，体重250~300 g，由河北省实验动物中心提供。硫酸化CCK-8购自美国Sigma公司；原位凋亡检测试剂盒购自华美生物公司；Trizol、dNTP、MMLV逆转录酶、Taq DNA聚合酶、oligo(dT)和TaqMan荧光探针购自Promega (Madison)。荧光定量PCR的引物由北京赛百盛公司合成，探针标记5′端FAM, 3′端TAMRA。兔抗鼠Bcl-2、Bax、β-actin、小鼠抗大鼠Caspase-3单克隆抗体均为Santa公司的产品。
1.2 方法
1.2.1 大鼠局部腦缺血/再灌注模型的制备 用自制尼龙丝线烧灼器将一长40 mm、直径0.25 mm 的尼龙丝线一端烧熔为直径约0.33 mm的光滑球端，然后将此尼龙线用75%酒精擦洗干净，在距球端18.5 mm处做标记，置0.9% 的无菌生理盐水中备用。将大鼠用10%水合氯醛生理盐水溶液麻醉（350mg/kg, ip），仰卧于手术台上，行尾动脉插管，用多道生理记录仪监测尾动脉血压、心率。颈正中切开皮肤，分离左侧颈外动脉(ECA) 、颈内动脉(ICA)，在ECA远心端结扎并离断，在 ECA 剪一小口注入60U肝素钠生理盐水溶液0.1ml后，将尼龙丝线由此切口插入ICA ，插入18.5±0.5mm左右阻断大脑中动脉（MCA）的血液供应，脑缺血1h后，将尼龙丝线轻轻向外拔，退至ECA残端恢复再灌注。动物苏醒后，返回鼠笼，于再灌注24h处死动物。 假手术对照组除不插尼龙丝线外，其它步骤同上。手术过程中，监测直肠温度，并保持在36.5℃~37.5℃。
1.2.2 侧脑室注射 脑室注射药物均以人工脑脊液作溶剂(artificial cerebrospinal fluid，ACSF，pH 7.4，浓度mmol/L：NaCl130，KCl 2.99，CaCl2 0.98，MgCl 2·6H2O 0.80，NaHCO3 25，Na2HPO4·12H2O 0.039，NaH2PO4·2H2O 0.46)。将麻醉大鼠固定于动物大脑定位仪(DGY-79A型，吉林省长春锻压设备厂)，切开额顶叶头皮，暴露前囟点。侧脑室坐标为：前囟点后0.8 mm，左旁开1.5 mm，硬膜下3.7 mm，根据坐标在顶骨上钻一直径0.5 mm的小孔，用10μL微量注射器吸取5μL药液，于1 min内匀速注入并留针2 min。
1.2.3 实验分组 动物随机分为3组：(1)假手术组(Sham)：无脑缺血，侧脑室穿刺后注射5μL的ACSF；(2)缺血/再灌注组(I/R)：夹闭颈总动脉前15min侧脑室注射5μL的ACSF；(3) CCK-8组+缺血/再灌注(CCK-8+I/R)：夹闭颈总动脉前15min侧脑室注射以5μL ACSF溶解的CCK-8（0.5μg、1.0μg、2.0μg、4.0 μg）。各组动物均于脑缺血2 h再灌注24 h 断头取脑。
1.2.4 脱氧核苷酸末端转移酶介导的DNA原位末端标记技术(TUNEL)检测海马神经元凋亡 将大鼠麻醉，开胸经升主动脉插管，依次灌注生理盐水和10g/L的甲醛各200ml断头取脑，取缺血侧半暗区脑组织置于同一甲醛溶液中固定3d，石蜡包埋。连续冠状切片，片厚5μm。应用原位凋亡检测试剂盒检测神经元的凋亡，严格按试剂盒说明书进行操作。阳性细胞核染成棕黄色，边界清楚。凋亡细胞计数时，每张切片在高倍镜下(400×)随机计数海马CA1区1 mm区段TUNUL阳性细胞数目，取平均值。
1.2.5 流式细胞术检测神经元凋亡率 再灌注24 h，各组随机取10只大鼠，断头取脑，在冰盘上快速分离出左侧大脑半暗区脑组织后放入70%乙醇溶液中固定，4℃保存。制备细胞混悬液，将混悬液用300目铜网过滤去除细胞团块，将细胞悬液离心2 min(500~800r/min)。取1×105细胞(0.1 ml)加入溴化乙锭(ethidium bromide，EB)染液1 ml，在4℃避光条件下进行DNA染色30min，流式细胞仪进行单参数检测。检测前以鸡血红细胞作为标准样品，调整仪器的变异系数(CV)在5%以内，测量数据输入HP-Consort30计算机，应用single histogram statistics软件进行处理并打印出结果。
1.2.6 凋亡相关基因检测 对凋亡相关基因（bax; bcl-2）mRNA检测采用荧光定量RT-PCR方法测定。Trizol提取左侧大脑半暗区脑组织中的总RNA，oligo d(T)18和M-MLV逆转录酶将RNA转录到cDNA，PCR反应体系50μL包括5μL10×PCR buffer，5μL cDNA模板或标准品DNA, 4μL 2.5 mmol/LdNTPs，5 U Taq DNA聚合酶, 1μL ROX ( Invitro-gen, Ca.t No. 12223-012), 15 pmol引物和10 pmol TaqMan探针，其中bax、bcl-2和β-actin的引物及探针由北京赛百盛公司合成，标准品由中心实验室提供。反应体系在ABI PRISM 7300仪器完成。反应条件为95℃预变性5 min，然后95℃15 s，60℃1 min共40个循环。Bax、bcl-2结果由β-actin校正。
1.2.7 Western blot分析 左侧大脑皮层及海马半暗区脑组织称重，加入组织裂解液(10% W/V)(50 mM Tris、150 mM NaCl、1% TritonX-100、0.5% 脫氧胆酸钠、1 mM PMSF、0.1% SDS、10 mM NaF、1mM钒酸钠、40 ?g/ml蛋白酶抑制剂混合物)于4℃下匀浆，4℃，12 000 g离心10 min，吸取上清，以考马斯亮蓝G250法进行蛋白定量后将制备好的蛋白样品置-80℃冰箱保存备用。各组取50 ?g样品蛋白行12% SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(100 V，3h)后转入硝酸纤维素膜。应用3%脱脂奶粉(PBS稀释，pH 7.4)室温封闭硝酸纤维素膜1h，分别加入bax、bcl-2、Caspase-3与β-actin一抗溶于0.5%抗体稀释液中(以1: 1000的比例稀释)，4℃密封过夜。TPBS振荡洗膜后，应用辣根过氧化物酶标记的二抗及DAB显色试剂盒进行检测，以出现棕黄色条带为阳性结果。用GDS凝胶图像处理系统分别分析bax、bcl-2和Caspase-3蛋白条带的IOD值和β-actin蛋白的IOD值，以bax、bcl-2、Caspase-3与β-actin蛋白的IOD比值分别代表bax、bcl-2和Caspase-3蛋白的相对表达量。
1.3 统计学方法 数据用均数±标准差(ｘ±s )表示，用SPSS 11.5软件进行统计分析。组间差异用单因素方差分析（one-way ANOVA），有显著差异者用Student-Newmen-Kuels q检验进行两两比较。
2 结果
2.1 海马神经元凋亡数目的变化
TUNEL染色显示，sham组偶有TUNEL阳性细胞，阳性细胞数为2±1.6。缺血再灌注组CA1区可见大量棕黄色着色的TUNEL阳性细胞，与sham组相比，TUNEL阳性细胞数量明显增加（P<0.01）。在CCK-8（1.0μg和2.0μg）处理组，TUNEL阳性神经元数与脑缺血组相比明显减少（P均<0.05）。
2.2 神经元凋亡率的变化
流式细胞术结果显示，假手术组神经元凋亡率较低，缺血再灌注组半暗区脑组织神经元凋亡率明显增高；CCK-8（1.0μg和2.0μg）处理可明显降低神经元凋亡率(表1)。
2.3 凋亡相关基因（bax; bcl-2）mRNA和蛋白表达的变化
与Sham组相比，缺血/再灌注组大鼠脑组织中bax mRNA和蛋白表达增加，而bcl-2 mRNA和蛋白表达减少，1.0μg和2.0μg CCK-8可降低局部脑I/R引起的大鼠脑组织中p53 和 bax mRNA和蛋白表达，而增加bcl-2 mRNA和蛋白表达。
2.4 Caspase-3蛋白表达的变化
与Sham组相比，局部脑I/R组大鼠Caspase-3蛋白表达增加，1.0μg和2.0μg CCK-8可降低Caspase-3蛋白表达。
3 讨论
缺血再灌注损伤是一个复杂的病理生理过程，最终引发缺血级联反应，导致神经元死亡。在脑缺血急性期，细胞凋亡主要出现在缺血半暗带区。本组实验中缺血再灌注24 h后，大鼠缺血半暗带区出现大量的TUNEL阳性细胞。这与相关报道的大鼠缺血再灌注损伤后细胞凋亡的规律相符合。
细胞凋亡的发生取决于促凋亡蛋白和抑凋亡蛋白浓度。目前研究发现，脑缺血神经元凋亡受多种基因调控。Bcl-2是典型的抑凋亡蛋白，而Bax则诱导细胞凋亡。本实验中，假手术组脑组织Bcl-2和Bax只有少量表达，而缺血1h再灌注24h后大鼠缺血侧半暗带脑组织中Bcl-2明显减少而Bax表达明显增多，Caspase-3蛋白表达显著增多。结果提示再灌注后缺血半暗带细胞凋亡反应增加，这与TUNEL阳性神经元数目和神经元细胞凋亡率改变一致。
CCK及其受体广泛存在于脑组织中，近年的研究报道，实验动物局部脑缺血前、后给予CCK-8均可改善血液循环障碍，从而减轻脑组织损伤，但其保护作用是否与抑制神经元凋亡有关尚不清楚。本研究发现，预先给予外源性CCK-8可明显抑制缺血再灌注所致的海马神经元凋亡，同时CCK-8可上调凋亡抑制因子Bcl-2，下调凋亡诱导因子Bax mRNA和蛋白表达，减少Caspase-3蛋白表达。结果证明，缺血再灌注损伤发生时，CCK-8通过调控凋亡相关基因的表达减轻神经细胞凋亡反应的发生，发挥脑保护作用。另外本实验发现，CCK-8抗脑缺血再灌注损伤的作用具有双相性和剂量相关性：小剂量时(如≤1μg)，可剂量依赖地抑制局部脑缺血再灌注大鼠大脑神经元细胞凋亡；剂量超过1μg时，这种保护作用则呈剂量依赖地减弱。