论文部分内容阅读
[摘要]目的探讨阿齐沙坦对转化生长因子_β(TGF_β)诱导的自发性高血压大鼠血管平滑肌细胞(VSMCs)增殖及迁移的影响。方法采用组织块贴壁培养法进行血管平滑肌细胞的原代培养,取3~5代细胞用于实验。用MTT法测定细胞增殖情况,用Boyden小室测试细胞迁移情况。采用10ng/ml TGF_β刺激VSMCs,并用阿齐沙坦干预,24h后用Western blot和RT_PCR检测VSMCs中MMP_2、MMP_9及TIMP_1蛋白和mRNA的表达。结果TGF_β可促进大鼠VSMCs的增殖及迁移,并增加大鼠VSMCs的MMP_2、MMP_9和TIMP_1蛋白表达。阿齐沙坦则可抑制TGF_β诱导的大鼠VSMCs的增殖和迁移,并降低大鼠VSMCs的MMP_2、MMP_9及TIMP_1表达。结论阿齐沙坦可能通过下调MMP_2、MMP_9及TIMP_1的表达来抑制TGF_β诱导的自发性高血压血管平滑肌细胞的增殖及迁移。
[关键词]MMP_2;MMP_9;TIMP_1;血管平滑肌细胞;增殖;迁移;阿齐沙坦
中图分类号:R544.1文献标识码:A文章编号:1009_816X(2014)04_0274_04
[Abstract] Objective To investigate the effects of azilsartan on TGF_β_induced spontaneously hypertensive vascular smooth muscle cells (VSMCs) proliferation and migration. Methods Rat VSMCs were cultivated by the method of tissue explants adherence. Cells of generation 3 to 5 were used as the experimental system. The MTT test was used to measure cell proliferation and Boyden chamber assay was used to measure cell migration. Primary cultured VSMCs were treated by 10 ng/ml TGF_β and azilsartan for 24 hours. The expression of MMP_2, MMP_9, TIMP_1 were measured by Western blot and RT_PCR. Results The expression of MMP_2, MMP_9 and TIMP_1 in rat VSMCs stimulated by TGF_β increased significantly. VSMCs migration and proliferation also increased significantly. Azilsartan significantly inhibited TGF_β induced MMP_2, MMP_9 and TIMP_1 production in rat VSMCs, as well as VSMCs proliferation and migration. Conclusions Azilsartan inhibited TGF_β_induced VSMCs proliferation and migration by down_regulation the expression of MMP_2, MMP_9, TIMP_1.
[Key words] MMP_2; MMP_9; TIMP_1; Vascular smooth muscle cells ;Proliferation; Migration; Azilsartan
自发性高血压是最常见的心血管疾病,以体循环动脉压升高为主要特点。高血压伴发的血管重构包括血管壁腔比增加、小动脉稀少及血管功能异常。基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase,MMPs)是参与降解全身各种组织细胞外基质(extracellular matrix,ECM)的蛋白酶家族,参与正常和病理条件下的组织重构,金属蛋白酶组织抑制物(TIMP)是MMPs的特异性抑制物[1]。MMPs/TIMP的动态改变,造成选择性的降解ECM,从而调整血管内皮细胞形态、生长和成活[2]。血管紧张素Ⅱ受体拮抗剂可能是通过抑制局部肾素血管紧张素醛固酮系统(RAS)活性和缓激肽的降解来抑制或逆转血管重构[3]。阿齐沙坦是一种血管紧张素Ⅱ受体拮抗剂,多用于治疗高血压病[4]。但沙坦类药物是否可抑制血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells,VSMCs)中MMPs/TIMP的表达则鲜有报道。通过药物抑制MMPs/TIMP活性,减少细胞外基质的降解,阻止血管平滑肌细胞的增殖和迁移是防治高血压发生、发展的一个可能的切入点。本研究观察血管紧张素Ⅱ受体拮抗剂阿齐沙坦对血管平滑肌细胞中MMP_2、MMP_9和TIMP_1蛋白表达的影响,探讨转化生长因子_β(TGF_β)在自发性高血压大鼠发生、发展进程中诱导细胞外MMPs/TIMP分泌及促平滑肌细胞迁移、增殖能力,为临床应用阿齐沙坦治疗高血压提供指导信息。
1资料和方法
1.1材料:自发性高血压大鼠(SHR)和同一株系的正常血压大鼠(WKY)大鼠(购自上海第二医科大学附属瑞金医院高血压研究所),雄性,7~10周龄。血压:SHR>170mmHg(1mmHg=0.113kPa),WKY<100mmHg。CO2细胞培养箱(Thermo Forma,美国),酶联免疫检测仪(Bio Tek,美国),流式细胞仪(BD,美国),Bio_Rad iQ5实时定量PCR仪、激光共聚焦显微镜(Lavision,德国),ECL化学发光试剂盒(Fermentas,加拿大),BCA蛋白浓度测定试剂盒、抗MMP_2多克隆抗体、抗MMP_9多克隆抗体、抗TIMP_1多克隆抗体(Santa Cruz,美国)DMEM培养基、胎牛血清、MTT、DMSO、TBST缓冲液、碘化吡啶(赛默飞世尔生物化学制品有限公司,北京),阿齐沙坦(武田制药公司,日本)。 1.2实验分组:将大鼠断头处死,无菌情况下分离胸主动脉,剪碎后加入含有20%胎牛血清的DMEM培养液,用贴壁细胞培养法行原代细胞培养至细胞长成致密单层后传代,取3~5代细胞用于实验。在传代过程中,细胞以5×105个/ml接种于6孔板培养板上。实验前48h换成不含血清的DMEM,使细胞处于静止状态。将培养的VSMC分成6组:WKY组、SHR组;TGF_β刺激WKY组、TGF_β刺激SHR组:10ng/ml TGF_β诱导增殖;TGF_β刺激WKY组阿齐沙坦给药组、TGF_β刺激SHR组阿齐沙坦给药组:50μmol/ml阿齐沙坦预处理30min后,用10ng/ml TGF_β诱导增殖。各组均应用0.2%胎血清培养液培养,培养24h后收集细胞。
1.3MTT法检测阿齐沙坦对TGF_β诱导的VSMCs细胞增殖的作用:取对数生长期细胞,以每孔3×104/孔均匀接种于96孔培养板内,按照上述分组方法将各组细胞悬液接种于96孔板上,培养24h后,结束实验,将每孔的培养液吸出,重新加入180μl培养液,然后每孔加入浓度为5mg/ml的MTT液20μl。在37℃培养箱内继续培养4h后,吸取培养液,每孔加入DMSO 200μl振荡10min,用酶联免疫检测仪在490nm波长测定各孔A值,取每组3孔的均值。
1.4Boyden趋化小室检测阿齐沙坦对TGF_β诱导的VSMCs细胞迁移的影响:取对数生长期的VSMCs,将培养的VSMCs分成6组观察VSMCs迁移:WKY组、SHR组:上室中加入未经处理的VSMCs悬液,下室中加人DMEM;TGF_β刺激WKY组、TGF_β刺激SHR组:上室中加入未经处理的VSMCs悬液,下室中加入10ng/ml TGF_β 0.5ml;TGF_β刺激WKY组阿齐沙坦给药组、TGF_β刺激SHR组阿齐沙坦给药组:上室中加入50μmol/ml阿齐沙坦孵育2h的VSMCs悬液,下室中加入10ng/ml TGF_β 0.5ml。上、下室之间隔以8μm孔径聚碳酸酯滤膜。将建立好的Boyden小室放入一容器培养24h后取出滤膜,固定、染色,在高倍镜下(×400)随机观察6个视野,计数移行细胞数,取平均值。
1.5Western blot检测蛋白表达:取对数生长期细胞,0.05%胰蛋白酶消化,PBS洗涤两次后离心弃上清,加入含全酶抑制剂和PMSF的RIPA裂解液冰浴裂解提取总蛋白。BCA法测定样品蛋白浓度,完成十二磺基硫酸钠/聚丙烯酸胺凝胶电泳和蛋白转膜操作,膜片分别与一抗(抗MMP_2多克隆抗体、抗MMP_9多克隆抗体、抗TIMP_1多克隆抗体)进行抗原抗体结合反应,再与辣根酶标记二抗反应,经适当洗涤,膜片与ECL温浴1min,保鲜膜包裹后,经X光片曝光,显影和定影,最后对结果进行光密度扫描分析。
1.6RNA的提取及RT_PCR检测m_RNA表达:以Trizol提取细胞总RNA,按照试剂盒要求操作。MMP_2上游引物序列:5’_GCGACAAGAAGTATGGCTTC_3’,下游引物序列:5’_TGCCAAGGTCAATGTCAGGA_3’;MMP_9上游引物序列:5’_CGCAGACATCGTCATCCAGT_3’,下游引物序列:5’_GGATTGGCCTTGGAAGATGA_3’;TIMP_1上游引物序列:5’_CAATTCCGACCTCGTCATCA_3’,下游引物序列:5’_TCAGAGCCTTGGAGGAGCT_3’,按实验室常规方法进行PCR扩增。用反转录反应液2μl作为模板,加入2μl上游及下游引物和2μl Taq酶后用PCR仪扩增。循环步骤如下:变性94℃ 1min,58℃ 1min和72℃ 1min共35个循环;末次长7min,终止反应。以β_actin为内参,依据2_ΔΔCT法计算各组细胞mRNA的相对表达量。
1.7统计学处理:以SPSS16.0统计分析软件进行统计,计量资料用(x-±s)表达,组间比较采用t检验分析,P<0.05为差异有统计学意义。
2结果
2.1MTT法检测TGF_β对VSMCs细胞的增殖作用:见图1。MTT法检测结果如图所示:SHR和WKY组VSMCs,TGF_β刺激组细胞增殖水平均显著高于对照组和TGF_β+阿齐沙坦给药组(P<0.05)。TGF_β+阿齐沙坦给药组细胞增殖水平与对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)。另外,SHR组VSMCs细胞增殖水平均显著高于相同干预的WKY(#P<0.01)。
图1各组大鼠VSMCs细胞增殖水平的比较
2.2阿齐沙坦对TGF_β诱导的VSMCs细胞迁移的影响:见图2。与WKY组相比,SHR组细胞迁移数目明显增多(#P<0.01),SHR和WKY组VSMCs,TGF_β刺激组细胞迁移数目高于对照组和TGF_β+阿齐沙坦给药组(*P<0.05)。TGF_β+阿齐沙坦给药组细胞迁移数与对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)。
图2阿齐沙坦对TGF_β诱导的VSMCs细胞迁移的影响2.3各组VSMCs中MMP_2、MMP_9、TIMP_1蛋白水平比较:Western blot检测结果如图3所示:SHR和WKY组VSMCs,TGF_β刺激组MMP_2、MMP_9和TIMP_1蛋白表达水平均高于对照组和TGF_β+阿齐沙坦给药组(P<0.05)。TGF_β+阿齐沙坦给药组MMP_2、MMP_9和TIMP_1蛋白表达水平与对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)。各组SHR大鼠VSMCs中MMP_2、MMP_9和TIMP_1蛋白表达水平均显著高于相同干预的WKY大鼠(P<0.05)。
图3MMP_2、MMP_9和TIMP_1在各组细胞中的蛋白的表达
2.4各组VSMCs中MMP_2、MMP_9、TIMP_1 mRNA水平比较:RT_PCR检测结果见图4。SHR和WKY组VSMCs,TGF_β刺激组MMP_2、MMP_9和TIMP_1 mRNA表达水平均高于TGF_β+阿齐沙坦给药组(*P<0.05)。各组SHR组VSMCs中MMP_2、MMP_9和TIMP_1蛋白表达水平均显著高于相同干预的WKY组(#P<0.05)。TGF_β+阿齐沙坦给药组MMP_2、MMP_9和TIMP_1蛋白表达水平与对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)。图4MMP_2、MMP_9和TIMP_1在各组细胞中mRNA的表达
3讨论
自发性高血压的主要病理生理变化是血管收缩与重塑,血管平滑肌细胞的增殖和凋亡失衡是重要的原因之一[5]。各种致损伤原因引起的VSMCs异常增殖并且凋亡减少,造成血管管腔狭窄、闭塞、血管阻力增高、最终导致高血压。阿齐沙坦在血管平滑肌和肾上腺等多种组织中,可通过选择性阻断血管紧张素Ⅱ与AT1受体的结合而阻断血管紧张素Ⅱ的血管收缩和醛固酮分泌作用,故其作用不依赖于血管紧张素Ⅱ合成通路[6]。越来越多的研究表明MMPs的激活可能在VSMCs增殖过程中起重要作用。
[关键词]MMP_2;MMP_9;TIMP_1;血管平滑肌细胞;增殖;迁移;阿齐沙坦
中图分类号:R544.1文献标识码:A文章编号:1009_816X(2014)04_0274_04
[Abstract] Objective To investigate the effects of azilsartan on TGF_β_induced spontaneously hypertensive vascular smooth muscle cells (VSMCs) proliferation and migration. Methods Rat VSMCs were cultivated by the method of tissue explants adherence. Cells of generation 3 to 5 were used as the experimental system. The MTT test was used to measure cell proliferation and Boyden chamber assay was used to measure cell migration. Primary cultured VSMCs were treated by 10 ng/ml TGF_β and azilsartan for 24 hours. The expression of MMP_2, MMP_9, TIMP_1 were measured by Western blot and RT_PCR. Results The expression of MMP_2, MMP_9 and TIMP_1 in rat VSMCs stimulated by TGF_β increased significantly. VSMCs migration and proliferation also increased significantly. Azilsartan significantly inhibited TGF_β induced MMP_2, MMP_9 and TIMP_1 production in rat VSMCs, as well as VSMCs proliferation and migration. Conclusions Azilsartan inhibited TGF_β_induced VSMCs proliferation and migration by down_regulation the expression of MMP_2, MMP_9, TIMP_1.
[Key words] MMP_2; MMP_9; TIMP_1; Vascular smooth muscle cells ;Proliferation; Migration; Azilsartan
自发性高血压是最常见的心血管疾病,以体循环动脉压升高为主要特点。高血压伴发的血管重构包括血管壁腔比增加、小动脉稀少及血管功能异常。基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase,MMPs)是参与降解全身各种组织细胞外基质(extracellular matrix,ECM)的蛋白酶家族,参与正常和病理条件下的组织重构,金属蛋白酶组织抑制物(TIMP)是MMPs的特异性抑制物[1]。MMPs/TIMP的动态改变,造成选择性的降解ECM,从而调整血管内皮细胞形态、生长和成活[2]。血管紧张素Ⅱ受体拮抗剂可能是通过抑制局部肾素血管紧张素醛固酮系统(RAS)活性和缓激肽的降解来抑制或逆转血管重构[3]。阿齐沙坦是一种血管紧张素Ⅱ受体拮抗剂,多用于治疗高血压病[4]。但沙坦类药物是否可抑制血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells,VSMCs)中MMPs/TIMP的表达则鲜有报道。通过药物抑制MMPs/TIMP活性,减少细胞外基质的降解,阻止血管平滑肌细胞的增殖和迁移是防治高血压发生、发展的一个可能的切入点。本研究观察血管紧张素Ⅱ受体拮抗剂阿齐沙坦对血管平滑肌细胞中MMP_2、MMP_9和TIMP_1蛋白表达的影响,探讨转化生长因子_β(TGF_β)在自发性高血压大鼠发生、发展进程中诱导细胞外MMPs/TIMP分泌及促平滑肌细胞迁移、增殖能力,为临床应用阿齐沙坦治疗高血压提供指导信息。
1资料和方法
1.1材料:自发性高血压大鼠(SHR)和同一株系的正常血压大鼠(WKY)大鼠(购自上海第二医科大学附属瑞金医院高血压研究所),雄性,7~10周龄。血压:SHR>170mmHg(1mmHg=0.113kPa),WKY<100mmHg。CO2细胞培养箱(Thermo Forma,美国),酶联免疫检测仪(Bio Tek,美国),流式细胞仪(BD,美国),Bio_Rad iQ5实时定量PCR仪、激光共聚焦显微镜(Lavision,德国),ECL化学发光试剂盒(Fermentas,加拿大),BCA蛋白浓度测定试剂盒、抗MMP_2多克隆抗体、抗MMP_9多克隆抗体、抗TIMP_1多克隆抗体(Santa Cruz,美国)DMEM培养基、胎牛血清、MTT、DMSO、TBST缓冲液、碘化吡啶(赛默飞世尔生物化学制品有限公司,北京),阿齐沙坦(武田制药公司,日本)。 1.2实验分组:将大鼠断头处死,无菌情况下分离胸主动脉,剪碎后加入含有20%胎牛血清的DMEM培养液,用贴壁细胞培养法行原代细胞培养至细胞长成致密单层后传代,取3~5代细胞用于实验。在传代过程中,细胞以5×105个/ml接种于6孔板培养板上。实验前48h换成不含血清的DMEM,使细胞处于静止状态。将培养的VSMC分成6组:WKY组、SHR组;TGF_β刺激WKY组、TGF_β刺激SHR组:10ng/ml TGF_β诱导增殖;TGF_β刺激WKY组阿齐沙坦给药组、TGF_β刺激SHR组阿齐沙坦给药组:50μmol/ml阿齐沙坦预处理30min后,用10ng/ml TGF_β诱导增殖。各组均应用0.2%胎血清培养液培养,培养24h后收集细胞。
1.3MTT法检测阿齐沙坦对TGF_β诱导的VSMCs细胞增殖的作用:取对数生长期细胞,以每孔3×104/孔均匀接种于96孔培养板内,按照上述分组方法将各组细胞悬液接种于96孔板上,培养24h后,结束实验,将每孔的培养液吸出,重新加入180μl培养液,然后每孔加入浓度为5mg/ml的MTT液20μl。在37℃培养箱内继续培养4h后,吸取培养液,每孔加入DMSO 200μl振荡10min,用酶联免疫检测仪在490nm波长测定各孔A值,取每组3孔的均值。
1.4Boyden趋化小室检测阿齐沙坦对TGF_β诱导的VSMCs细胞迁移的影响:取对数生长期的VSMCs,将培养的VSMCs分成6组观察VSMCs迁移:WKY组、SHR组:上室中加入未经处理的VSMCs悬液,下室中加人DMEM;TGF_β刺激WKY组、TGF_β刺激SHR组:上室中加入未经处理的VSMCs悬液,下室中加入10ng/ml TGF_β 0.5ml;TGF_β刺激WKY组阿齐沙坦给药组、TGF_β刺激SHR组阿齐沙坦给药组:上室中加入50μmol/ml阿齐沙坦孵育2h的VSMCs悬液,下室中加入10ng/ml TGF_β 0.5ml。上、下室之间隔以8μm孔径聚碳酸酯滤膜。将建立好的Boyden小室放入一容器培养24h后取出滤膜,固定、染色,在高倍镜下(×400)随机观察6个视野,计数移行细胞数,取平均值。
1.5Western blot检测蛋白表达:取对数生长期细胞,0.05%胰蛋白酶消化,PBS洗涤两次后离心弃上清,加入含全酶抑制剂和PMSF的RIPA裂解液冰浴裂解提取总蛋白。BCA法测定样品蛋白浓度,完成十二磺基硫酸钠/聚丙烯酸胺凝胶电泳和蛋白转膜操作,膜片分别与一抗(抗MMP_2多克隆抗体、抗MMP_9多克隆抗体、抗TIMP_1多克隆抗体)进行抗原抗体结合反应,再与辣根酶标记二抗反应,经适当洗涤,膜片与ECL温浴1min,保鲜膜包裹后,经X光片曝光,显影和定影,最后对结果进行光密度扫描分析。
1.6RNA的提取及RT_PCR检测m_RNA表达:以Trizol提取细胞总RNA,按照试剂盒要求操作。MMP_2上游引物序列:5’_GCGACAAGAAGTATGGCTTC_3’,下游引物序列:5’_TGCCAAGGTCAATGTCAGGA_3’;MMP_9上游引物序列:5’_CGCAGACATCGTCATCCAGT_3’,下游引物序列:5’_GGATTGGCCTTGGAAGATGA_3’;TIMP_1上游引物序列:5’_CAATTCCGACCTCGTCATCA_3’,下游引物序列:5’_TCAGAGCCTTGGAGGAGCT_3’,按实验室常规方法进行PCR扩增。用反转录反应液2μl作为模板,加入2μl上游及下游引物和2μl Taq酶后用PCR仪扩增。循环步骤如下:变性94℃ 1min,58℃ 1min和72℃ 1min共35个循环;末次长7min,终止反应。以β_actin为内参,依据2_ΔΔCT法计算各组细胞mRNA的相对表达量。
1.7统计学处理:以SPSS16.0统计分析软件进行统计,计量资料用(x-±s)表达,组间比较采用t检验分析,P<0.05为差异有统计学意义。
2结果
2.1MTT法检测TGF_β对VSMCs细胞的增殖作用:见图1。MTT法检测结果如图所示:SHR和WKY组VSMCs,TGF_β刺激组细胞增殖水平均显著高于对照组和TGF_β+阿齐沙坦给药组(P<0.05)。TGF_β+阿齐沙坦给药组细胞增殖水平与对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)。另外,SHR组VSMCs细胞增殖水平均显著高于相同干预的WKY(#P<0.01)。
图1各组大鼠VSMCs细胞增殖水平的比较
2.2阿齐沙坦对TGF_β诱导的VSMCs细胞迁移的影响:见图2。与WKY组相比,SHR组细胞迁移数目明显增多(#P<0.01),SHR和WKY组VSMCs,TGF_β刺激组细胞迁移数目高于对照组和TGF_β+阿齐沙坦给药组(*P<0.05)。TGF_β+阿齐沙坦给药组细胞迁移数与对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)。
图2阿齐沙坦对TGF_β诱导的VSMCs细胞迁移的影响2.3各组VSMCs中MMP_2、MMP_9、TIMP_1蛋白水平比较:Western blot检测结果如图3所示:SHR和WKY组VSMCs,TGF_β刺激组MMP_2、MMP_9和TIMP_1蛋白表达水平均高于对照组和TGF_β+阿齐沙坦给药组(P<0.05)。TGF_β+阿齐沙坦给药组MMP_2、MMP_9和TIMP_1蛋白表达水平与对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)。各组SHR大鼠VSMCs中MMP_2、MMP_9和TIMP_1蛋白表达水平均显著高于相同干预的WKY大鼠(P<0.05)。
图3MMP_2、MMP_9和TIMP_1在各组细胞中的蛋白的表达
2.4各组VSMCs中MMP_2、MMP_9、TIMP_1 mRNA水平比较:RT_PCR检测结果见图4。SHR和WKY组VSMCs,TGF_β刺激组MMP_2、MMP_9和TIMP_1 mRNA表达水平均高于TGF_β+阿齐沙坦给药组(*P<0.05)。各组SHR组VSMCs中MMP_2、MMP_9和TIMP_1蛋白表达水平均显著高于相同干预的WKY组(#P<0.05)。TGF_β+阿齐沙坦给药组MMP_2、MMP_9和TIMP_1蛋白表达水平与对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)。图4MMP_2、MMP_9和TIMP_1在各组细胞中mRNA的表达
3讨论
自发性高血压的主要病理生理变化是血管收缩与重塑,血管平滑肌细胞的增殖和凋亡失衡是重要的原因之一[5]。各种致损伤原因引起的VSMCs异常增殖并且凋亡减少,造成血管管腔狭窄、闭塞、血管阻力增高、最终导致高血压。阿齐沙坦在血管平滑肌和肾上腺等多种组织中,可通过选择性阻断血管紧张素Ⅱ与AT1受体的结合而阻断血管紧张素Ⅱ的血管收缩和醛固酮分泌作用,故其作用不依赖于血管紧张素Ⅱ合成通路[6]。越来越多的研究表明MMPs的激活可能在VSMCs增殖过程中起重要作用。