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[摘要] 目的 以双氯芬酸钠为模型药物，研究广藿香挥发油对药物透皮吸收的促进作用。 方法 采用氮酮、广藿香挥发油预处理皮肤的方法，通过离体大鼠皮肤渗透释药试验，在不同时间点取样，测定接受液中双氯芬酸钠的浓度，计算累积透过量、稳态流量、渗透系数和滞后时间等指标。 结果 广藿香挥发油对双氯芬酸钠有促透作用，广藿香挥发油组和氮酮组的促渗作用差异有统计学意义（P<0.05），但比氮酮的弱；挥发油组可延长双氯芬酸钠的时滞，而氮酮组缩短双氯芬酸钠的时滞；透皮实验中，二者并未减弱双氯芬酸钠的贮库效应；去角质层实验中，二者均减弱了双氯芬酸钠的贮库效应。 结论 广藿香挥发油对双氯芬酸钠有一定的透皮吸收促进作用。
[关键词] 广藿香；挥发油；双氯芬酸钠；透皮吸收；贮库效应
[中图分类号] R94 [文献标识码] A [文章编号] 2095-0616（2013）10-33-03
药物经皮吸收的主要障碍为皮肤的角质层，透皮吸收促进剂可有效地克服此障碍。许多中药挥发性成分具有促透作用，且有起效快、效果好、副作用小、无污染的特点。因此，从中药挥发性成分中寻找新的促渗剂已成为近年研究热点[1-2]。为此，作者探讨了广藿香挥发油对模型药物双氯芬酸钠经皮吸收的影响。
1 实验部分
1.1 仪器、试药与动物
THZ-82型数显水浴恒温振荡器（江苏金坛市宏华仪器厂）；UV-1800分光光度计（北京瑞利仪器厂）；透皮吸收扩散装置（自制）。氮酮（AZ，中原化工厂）；双氯芬酸钠（广东省药品检验所），广藿香挥发油（自提），所用试剂为分析纯。
1.2 方法与结果
1.2.1 离体鼠皮的制备 剪短大鼠背部的毛，用脱毛剂脱毛，24 h后处死，直接取背部皮肤，仔细剥离皮下脂肪组织，用生理盐水反复冲洗，至不浑浊，部分皮肤用胶带，反复撕贴20次，即得去角质层皮肤。取完整皮肤和去角质层皮肤，置4℃冰箱中保存，1周内用完。取鼠皮，在常温下解冻，用纱布覆盖角质层表面，根据组别分别滴加0.5 mL广藿香挥发油及0.5 mL的氮酮，使之湿润至整个皮肤外表面，充分接触12 h后，除去纱布，用生理盐水反复冲洗干净，再用吸水纸吸干皮肤表面的液体，立即使用。
1.2.2 标准曲线的制作 精密称取50.00 mg双氯芬酸钠，置50 mL量瓶中，用生理盐水溶解、定容，制成1 mg/mL的贮备液，精密量取贮备液，用生理盐水稀释成50.00、40.00、35.00、30.00、25.00、20.00、15.00、12.50、10.00、6.25、3.12 μg/mL的系列溶液，分别在276 nm处测定其吸光度，以吸光度为纵坐标，以浓度为横坐标，求得标准曲线方程为y=2.33×10-2 x+6.86×10-2（r=0.9986），线性范围为3.12～50.00 μg/mL。
1.2.3 回收率和精密度试验 取已知准确含量的双氯芬酸钠，溶于100 mL生理盐水中，制得不同浓度的供试溶液，测定其吸光度，计算回收率与精密度（表1）。
1.2.4 透皮试验 实验分为对照组（A组）、氮酮组（B组）、广藿香挥发油组（C组）。将处理好的皮肤固定于双室透皮扩散装置上进行体外透皮吸收试验。供给液为0.1 mL的10 mg/mL双氯芬酸钠的生理盐水溶液，接受液为5.0 mL生理盐水，实验温度为（37.0±1.0）℃，振速为120次/min，扩散面积为0.502 cm2，在2、4、8、12、24 h时分别取4.0 mL，同时补加等量的接收液，测定吸光度，代入回归方程，计算药物浓度。连续透皮24 h后，除去供给液，用生理盐水反复清洗，并用滤纸条吸干，取5.0 mL接收液加入干净的接收瓶中，按上述条件进行药物贮库效应的研究。根据参考文献[3-4]中所列公式计算累计渗透量、渗透系数、时滞、增渗倍数等。
1.2.5 双氯芬酸钠的渗透曲线 将不同时间的累积透过量对时间作图，可得双氯芬酸钠的透皮吸收渗透曲线（图1、2），反映了药物在完整皮肤和去角质层皮肤的渗透特征，经线性回归得回归方程如表2、3，由相关系数r可知，方程线性良好，可见双氯芬酸钠的体外渗透近似呈零级动力学方式，透皮速率近似恒定。
1.3 统计学处理
记录每组实验数据，根据参考文献中计算公式，计算累计渗透量、渗透系数、时滞、增渗倍数等。所有数据采用医学统计学软件SAS8.2进行统计学分析，计量资料均采用（）表示，采用t检验。P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 回收率与精密度试验
由表1可知，紫外分光光度法测定双氯芬酸纳的方法可靠、准确、重复性好。
2.2 广藿香挥发油对双氯芬酸钠体外透皮速率的影响
由表2可知，从稳态流量和渗透系数来看（完整皮肤），广藿香挥发油和氮酮对双氯芬酸钠均有显著的促渗作用（P<0.05）；从对时滞的影响可以看出，氮酮可明显缩短双氯芬酸钠的透皮吸收时滞（P<0.05），而广藿香挥发油却延长了其透皮吸收时滞；从增渗比ER可以看出氮酮对渗透系数提高倍数大。
由表3可知，从稳态流量和渗透系数来看（去角质层皮肤），两种促渗剂在去除角质层后的促渗作用和增渗倍数差异无统计学意义（P>0.05）；从时滞来看，去除角质层后，氮酮可缩短双氯芬酸钠的透皮吸收时滞，而广藿香挥发油则明显延长了其透皮吸收时滞（P<0.05）。
经统计检验，去角质层的皮肤与完整皮肤比较，空白对照组A的稳态流量和渗透系数差异有统计学意义（P<0.05）；氮酮组与广藿香挥发油组均差异无统计学意义（P>0.05）。提示角质层是药物通过皮肤的主要障碍。
2.3 广藿香挥发油对双氯芬酸钠体外透皮贮库效应的影响
由表4可知，氮酮组和广藿香挥发油组并未减弱双氯芬酸钠的贮库效应，氮酮组和空白组之间差异有统计学意义（P<0.05），而广藿香挥发油组和空白组之间差异无统计学意义（P>0.05）；从时滞上可以看出，氮酮缩短了双氯芬酸钠的透皮吸收时滞，但广藿香却明显延长了双氯芬酸钠的透皮吸收时滞（P<0.05）。从增渗比ER可以看出氮酮的渗透倍数较广藿香挥发油的大。 由表5可知，从稳态流量和渗透系数来看，氮酮组和广藿香挥发油组均减弱了双氯芬酸钠的贮库效应，而二者的促渗作用差异无统计学意义（P>0.05）；增渗倍数也无显著性差异，但二者均缩短了双氯芬酸钠的透皮吸收时滞。
经统计学检验，去角质层的皮肤与完整皮肤比较，去除释放液后，氮酮组中双氯芬酸钠的稳态流量和渗透系数差异有统计学意义（P<0.05）；广藿香挥发油组中则无统计学意义；但两者比较，广藿香挥发油组双氯芬酸钠的稳态流量和渗透系数均减少，提示角质层具有贮库作用。
3 讨论
实验研究中发现广藿香挥发油和氮酮均具有促渗作用，广藿香挥发油的促渗作用较氮酮弱，统计学检验发现二者之间差异无统计学意义（P<0.05）。但在贮库效应的研究中，氮酮并没有减弱双氯芬酸钠的贮库作用，广藿香挥发油却减弱了双氯芬酸钠的贮库效应，可见二者在促渗方面各具有特点。
在整个皮肤结构中，角质层作为药物透皮吸收的限速层，使一些药物的透皮吸收发生困难。实验发现在去除角质层后，双氯芬酸钠的透皮作用明显增加，提示角质层是双氯芬酸钠透皮吸收的主要障碍。角质层中含有与药物结合的角蛋白，使药物停留在角质层中形成贮库，故去除释放液后，仍有药物释放，且可维持一定的时间。本实验研究发现在去除角质层的贮库效应研究中发现，当去除释放液后，仍有药物释放，可见药物在皮肤中形成贮库，并不是仅仅与角质层中的角蛋白结合，还可能与皮肤中的其他成分结合而停留在皮肤中。故而当去除释放液后，仍有药物释放。
研究发现许多萜类化合物具有一定的促透作用且化合物毒性小[5-6]，广藿香挥发油含有广藿香醇、刺蕊草烯等萜类化合物[7]，可能是其发挥促透作用的有效成分。本研究是采用广藿香总挥发油进行试验，具体是其中的哪种成分或几种成分在起作用，将是以后研究的一个方面。
[参考文献]
[1] 李莉，韩国柱.中草药挥发油类透皮吸收促进作用研究进展[J].中国新药杂志，2008，17（11）：914-918，946.
[2] Alper Okyar，Maksat Nuriyev，Ayca Yildiz，et al.The effect of terpenes on percutaneous absorption of tiaprofenic acid gel[J].Archives of Pharmacal Research，2010，33（11）：1781-1788.
[3] 沈非沉，王晖，郭源源，等.几种促透剂联合使用对双氯芬酸钠体外经裸小鼠皮肤吸收的影响[J].数理医药学杂志，2007，20（3）：362-365.
[4] 王晖，郭源源，陈垦，等.功效函数法评价薄荷醇与月桂氮芯卓酮对双氯芬酸钠的透皮吸收[J].中国医院药学杂志，2009，29（7）：528-531.
[5] Bharti Sapra， Subheet Jain， A. K. Tiwary.Percutaneous Permeation Enhancement by Terpenes：Mechanistic View[J].AAPS J，2008，10（1）：120-132.
[6] Fang JY，Tsai TH，Lin YY，et al.Transdermal delivery of tea catechins and theophylline enhanced by terpenes：a mechanistic study[J].Biol Pharm Bull，2007，30（2）：343-349.
[7] 王吉春.广藿香中挥发油成分的研究进展[J].中国医药指南，2010，8（11）：43-45.
（收稿日期：2013-03-15）
[关键词] 广藿香；挥发油；双氯芬酸钠；透皮吸收；贮库效应
[中图分类号] R94 [文献标识码] A [文章编号] 2095-0616（2013）10-33-03
药物经皮吸收的主要障碍为皮肤的角质层，透皮吸收促进剂可有效地克服此障碍。许多中药挥发性成分具有促透作用，且有起效快、效果好、副作用小、无污染的特点。因此，从中药挥发性成分中寻找新的促渗剂已成为近年研究热点[1-2]。为此，作者探讨了广藿香挥发油对模型药物双氯芬酸钠经皮吸收的影响。
1 实验部分
1.1 仪器、试药与动物
THZ-82型数显水浴恒温振荡器（江苏金坛市宏华仪器厂）；UV-1800分光光度计（北京瑞利仪器厂）；透皮吸收扩散装置（自制）。氮酮（AZ，中原化工厂）；双氯芬酸钠（广东省药品检验所），广藿香挥发油（自提），所用试剂为分析纯。
1.2 方法与结果
1.2.1 离体鼠皮的制备 剪短大鼠背部的毛，用脱毛剂脱毛，24 h后处死，直接取背部皮肤，仔细剥离皮下脂肪组织，用生理盐水反复冲洗，至不浑浊，部分皮肤用胶带，反复撕贴20次，即得去角质层皮肤。取完整皮肤和去角质层皮肤，置4℃冰箱中保存，1周内用完。取鼠皮，在常温下解冻，用纱布覆盖角质层表面，根据组别分别滴加0.5 mL广藿香挥发油及0.5 mL的氮酮，使之湿润至整个皮肤外表面，充分接触12 h后，除去纱布，用生理盐水反复冲洗干净，再用吸水纸吸干皮肤表面的液体，立即使用。
1.2.2 标准曲线的制作 精密称取50.00 mg双氯芬酸钠，置50 mL量瓶中，用生理盐水溶解、定容，制成1 mg/mL的贮备液，精密量取贮备液，用生理盐水稀释成50.00、40.00、35.00、30.00、25.00、20.00、15.00、12.50、10.00、6.25、3.12 μg/mL的系列溶液，分别在276 nm处测定其吸光度，以吸光度为纵坐标，以浓度为横坐标，求得标准曲线方程为y=2.33×10-2 x+6.86×10-2（r=0.9986），线性范围为3.12～50.00 μg/mL。
1.2.3 回收率和精密度试验 取已知准确含量的双氯芬酸钠，溶于100 mL生理盐水中，制得不同浓度的供试溶液，测定其吸光度，计算回收率与精密度（表1）。
1.2.4 透皮试验 实验分为对照组（A组）、氮酮组（B组）、广藿香挥发油组（C组）。将处理好的皮肤固定于双室透皮扩散装置上进行体外透皮吸收试验。供给液为0.1 mL的10 mg/mL双氯芬酸钠的生理盐水溶液，接受液为5.0 mL生理盐水，实验温度为（37.0±1.0）℃，振速为120次/min，扩散面积为0.502 cm2，在2、4、8、12、24 h时分别取4.0 mL，同时补加等量的接收液，测定吸光度，代入回归方程，计算药物浓度。连续透皮24 h后，除去供给液，用生理盐水反复清洗，并用滤纸条吸干，取5.0 mL接收液加入干净的接收瓶中，按上述条件进行药物贮库效应的研究。根据参考文献[3-4]中所列公式计算累计渗透量、渗透系数、时滞、增渗倍数等。
1.2.5 双氯芬酸钠的渗透曲线 将不同时间的累积透过量对时间作图，可得双氯芬酸钠的透皮吸收渗透曲线（图1、2），反映了药物在完整皮肤和去角质层皮肤的渗透特征，经线性回归得回归方程如表2、3，由相关系数r可知，方程线性良好，可见双氯芬酸钠的体外渗透近似呈零级动力学方式，透皮速率近似恒定。
1.3 统计学处理
记录每组实验数据，根据参考文献中计算公式，计算累计渗透量、渗透系数、时滞、增渗倍数等。所有数据采用医学统计学软件SAS8.2进行统计学分析，计量资料均采用（）表示，采用t检验。P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 回收率与精密度试验
由表1可知，紫外分光光度法测定双氯芬酸纳的方法可靠、准确、重复性好。
2.2 广藿香挥发油对双氯芬酸钠体外透皮速率的影响
由表2可知，从稳态流量和渗透系数来看（完整皮肤），广藿香挥发油和氮酮对双氯芬酸钠均有显著的促渗作用（P<0.05）；从对时滞的影响可以看出，氮酮可明显缩短双氯芬酸钠的透皮吸收时滞（P<0.05），而广藿香挥发油却延长了其透皮吸收时滞；从增渗比ER可以看出氮酮对渗透系数提高倍数大。
由表3可知，从稳态流量和渗透系数来看（去角质层皮肤），两种促渗剂在去除角质层后的促渗作用和增渗倍数差异无统计学意义（P>0.05）；从时滞来看，去除角质层后，氮酮可缩短双氯芬酸钠的透皮吸收时滞，而广藿香挥发油则明显延长了其透皮吸收时滞（P<0.05）。
经统计检验，去角质层的皮肤与完整皮肤比较，空白对照组A的稳态流量和渗透系数差异有统计学意义（P<0.05）；氮酮组与广藿香挥发油组均差异无统计学意义（P>0.05）。提示角质层是药物通过皮肤的主要障碍。
2.3 广藿香挥发油对双氯芬酸钠体外透皮贮库效应的影响
由表4可知，氮酮组和广藿香挥发油组并未减弱双氯芬酸钠的贮库效应，氮酮组和空白组之间差异有统计学意义（P<0.05），而广藿香挥发油组和空白组之间差异无统计学意义（P>0.05）；从时滞上可以看出，氮酮缩短了双氯芬酸钠的透皮吸收时滞，但广藿香却明显延长了双氯芬酸钠的透皮吸收时滞（P<0.05）。从增渗比ER可以看出氮酮的渗透倍数较广藿香挥发油的大。 由表5可知，从稳态流量和渗透系数来看，氮酮组和广藿香挥发油组均减弱了双氯芬酸钠的贮库效应，而二者的促渗作用差异无统计学意义（P>0.05）；增渗倍数也无显著性差异，但二者均缩短了双氯芬酸钠的透皮吸收时滞。
经统计学检验，去角质层的皮肤与完整皮肤比较，去除释放液后，氮酮组中双氯芬酸钠的稳态流量和渗透系数差异有统计学意义（P<0.05）；广藿香挥发油组中则无统计学意义；但两者比较，广藿香挥发油组双氯芬酸钠的稳态流量和渗透系数均减少，提示角质层具有贮库作用。
3 讨论
实验研究中发现广藿香挥发油和氮酮均具有促渗作用，广藿香挥发油的促渗作用较氮酮弱，统计学检验发现二者之间差异无统计学意义（P<0.05）。但在贮库效应的研究中，氮酮并没有减弱双氯芬酸钠的贮库作用，广藿香挥发油却减弱了双氯芬酸钠的贮库效应，可见二者在促渗方面各具有特点。
在整个皮肤结构中，角质层作为药物透皮吸收的限速层，使一些药物的透皮吸收发生困难。实验发现在去除角质层后，双氯芬酸钠的透皮作用明显增加，提示角质层是双氯芬酸钠透皮吸收的主要障碍。角质层中含有与药物结合的角蛋白，使药物停留在角质层中形成贮库，故去除释放液后，仍有药物释放，且可维持一定的时间。本实验研究发现在去除角质层的贮库效应研究中发现，当去除释放液后，仍有药物释放，可见药物在皮肤中形成贮库，并不是仅仅与角质层中的角蛋白结合，还可能与皮肤中的其他成分结合而停留在皮肤中。故而当去除释放液后，仍有药物释放。
研究发现许多萜类化合物具有一定的促透作用且化合物毒性小[5-6]，广藿香挥发油含有广藿香醇、刺蕊草烯等萜类化合物[7]，可能是其发挥促透作用的有效成分。本研究是采用广藿香总挥发油进行试验，具体是其中的哪种成分或几种成分在起作用，将是以后研究的一个方面。
[参考文献]
[1] 李莉，韩国柱.中草药挥发油类透皮吸收促进作用研究进展[J].中国新药杂志，2008，17（11）：914-918，946.
[2] Alper Okyar，Maksat Nuriyev，Ayca Yildiz，et al.The effect of terpenes on percutaneous absorption of tiaprofenic acid gel[J].Archives of Pharmacal Research，2010，33（11）：1781-1788.
[3] 沈非沉，王晖，郭源源，等.几种促透剂联合使用对双氯芬酸钠体外经裸小鼠皮肤吸收的影响[J].数理医药学杂志，2007，20（3）：362-365.
[4] 王晖，郭源源，陈垦，等.功效函数法评价薄荷醇与月桂氮芯卓酮对双氯芬酸钠的透皮吸收[J].中国医院药学杂志，2009，29（7）：528-531.
[5] Bharti Sapra， Subheet Jain， A. K. Tiwary.Percutaneous Permeation Enhancement by Terpenes：Mechanistic View[J].AAPS J，2008，10（1）：120-132.
[6] Fang JY，Tsai TH，Lin YY，et al.Transdermal delivery of tea catechins and theophylline enhanced by terpenes：a mechanistic study[J].Biol Pharm Bull，2007，30（2）：343-349.
[7] 王吉春.广藿香中挥发油成分的研究进展[J].中国医药指南，2010，8（11）：43-45.
（收稿日期：2013-03-15）