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[摘要] 目的 构建恶性疟原虫多期多表位基因的真核表达载体及其免疫学特性的研究。方法 在前期研究基础上，将测序正确的恶性疟原虫多期多表位基因克隆入真核表达载体VR1020内并大量制备。以VR1020重组质粒免疫HHD-2小鼠并进行细胞和体液免疫分析。结果 成功获得重组真核表达载体，ELISA显示该重组质粒免疫小鼠后获得了较高效价的抗体，而且显示了较好的CTL杀伤活性，同时诱导了高水平的细胞因子。结论 本研究为新型疟疾疫苗的研制奠定一定的理论和实践基础。
[关键词] 恶性疟原虫；疫苗；多表位基因
[中图分类号] R392.1 [文献标识码] A [文章编号] 2095-0616（2013）10-26-03
疟疾是严重危害人类健康的热带传染病，在非洲仅次于HIV/AIDS，排在第2位。疟疾疫苗的研制对儿童、孕妇等高危人群的保护方面尤为重要。但是，由于疟原虫具有复杂的生活史、抗原变异等特点，疫苗的研制仍是困难重重。目前已经结束Ⅲ期临床试验的RTS，S疫苗对低龄婴儿的保护率仅为53%左右[1-2]，但这已经是疟疾疫苗研究领域非常重大的突破。在疟原虫的生活史过程中，子孢子入侵肝细胞和裂殖子入侵红细胞是两个有决定性意义的步骤，截止目前尚无一种疫苗或疫苗免疫策略可成功兼顾疟原虫红细胞内期和肝细胞内期。我们在前期构建疟原虫联合红内期和肝内期的多表位基因的基础上，构建其真核表达载体并且研究其诱导小鼠的免疫应答。本研究从体液免疫和细胞免疫水平研究该多期多表位疫苗的免疫学特性，为研究新型疟疾疫苗提供理论和实践基础。
1 材料与方法
1.1 一般材料
DNA免疫用载体质粒VR1020由美国海军医学研究所
的Stephen L.Hoffman博士惠赠。T-AMA-1和T-MEG均为本教研室制备，HHD-2小鼠由本教研室转基因动物室提供。
1.2 方法
1.2.1 VR1020/AMAMEG重组表达载体的构建 采用参考文献[3]方法，用BamHI和BgLII双酶切的真核载体VR1020，以BamHI和NdeI双酶切T-AMA-1，以NdeI和BgLII双酶切T-MEG，将三片段用T4DNA连接酶连接，转化DH5α。重组质粒VR1020 /AMAMEG采用双酶切鉴定，并送TaKaRa公司进行核苷酸序列测定。
1.2.2 VR1020/AMAMEG重组质粒的大量制备 将重组质粒VR1020/AMAMEG阳性克隆接种于卡那抗性的LB培养基中，37℃，220 rpm震荡12 h，次日1∶1000比例稀释到100 mL卡那抗性的LB培养基中，37℃，220 rpm震荡培养12 h，离心收集菌体，大提质粒试剂盒提取VR1020/AMAMEG质粒。
1.2.3 VR1020/AMAMEG重组免疫小鼠 每组5只，免疫前用0.75%戊巴比妥钠75 mg/kg腹腔麻醉。于0周，3周，6周免疫3次，每只小鼠DNA免疫量为100?g，多点肌肉注射。
1.2.4 ELISA检测抗体效价 应用文献[4]方法，简言之：用纯化的AMA融合蛋白作为包被抗原，0.1μg每孔，待检血清1∶100稀释后每孔加入100 μL，37℃放置1 h；PBS洗5次，加入1∶10000稀释的HRP-羊抗鼠IgG，37℃放置1 h；PBS洗5次，加入TMB显色，加入2M硫酸50μL/孔终止显色，OD490处测吸光度。
1.2.5 细胞因子的诱生及其测定 用RPMI-1640完全培养液将各组免疫小鼠脾细胞调整至5×106/mL，加入24孔板中培养，800 μL/孔，分别加入MEGAMA纯化蛋白10 μg/孔，对照组不加蛋白；置5% CO2孵箱中37℃培养42 h，收集培养液，5000 rpm离心5 min，取上清，-20℃冻存备检；IFN-γ及IL-2含量的测定，参照试剂盒说明书进行（夹心ELISA法）。
1.2.6 CTL杀伤实验 免疫小鼠后第12周分离免疫小鼠脾脏淋巴细胞，调整细胞浓度为1×107个/mL，置于96孔培养板中用RPMI 1640完全培养基培养，加入MEGAMA纯化蛋白至终浓度为10 μmol/L，继续培养2 d，作为效应细胞；C1R-AD细胞作为靶细胞。按不同的效靶比进行CTL杀伤实验，乳酸脱氢酶实验检测CTL的细胞毒活性，并按下面的公式计算杀伤率：细胞杀伤率=（实验组平均A值-自然释放对照组平均A值）/（最大释放对照组平均A值-自然释放对照组平均A值）×100%。
2 结果
2.1 VR1020 /AMAMEG重组载体的酶切鉴定
经BamHI和BgLII双酶切VR1020 /AMAMEG，得到1400 bp左右的片段（图1），与预期片段大小一致，测序分析显示序列与原始设计序列完全一致。
M-2000bp DNA标志物；1-VR1020/AMAMEG双酶切
2.2 VR1020 /AMAMEG免疫小鼠后抗体效价
将VR1020 /AMAMEG免疫HHD-2小鼠，ELISA测定抗血清效价在免疫6周时上升较高，到9周时达到高峰。见图2。
2.3 VR1020 /AMAMEG免疫后细胞因子诱生情况
结果见图3A，B所示，重组DNA疫苗组和VR1020对照组IFN-γ和IL-2水平均高于对照组（P<0.01），且重组DNA疫苗免疫组高于VR1020空载体组（P<0.05）；提示重组DNA疫苗能够诱导有效的细胞免疫应答。
2.4 VR1020 /AMAMEG免疫后诱导CTL杀伤情况
结果见图4所示，重组DNA疫苗组的平均杀伤活性达到46.9%，VR1020组和生理盐水组分别为18.4%和8.6%。重组DNA疫苗诱导的CTL活性在效靶比为100∶1时达到最高，为72.3%，显著高于生理盐水组（8.8%）和VR1020组（19.05%）。 3 讨论
本研究基于多期多表位的重组疟疾DNA疫苗构建和免疫学特性研究，以VR1020作为载体，以改造隐性表位为基础的多串联的CTL表位基因和疟原虫顶端膜抗原AMA-1作为目标基因片段构建重组真核表达载体。VR1020载体具有CMV的立即早期增强子/启动子复合体，在启动子与编码序列之间插入了CMV立即早期基因的第一个内含子Intron A，来自人组织凝血酶原激活物（TPA）的信号肽序列位于多克隆位点的5’端，可引导目的蛋白进行分泌表达，而且该载体是美国FDA批准的少数可以用于人体的真核表达载体之一，目前用于较多的DNA疫苗研制中[5-6]。从实验结果上看是能够诱导较高水平的抗体产生，也能够活化IL-2等的细胞因子，以及诱导CTL来杀伤相应靶细胞。该重组恶性疟原虫多期多表位真核表达载体免疫小鼠免疫学特性研究显示兼顾了体液免疫和细胞免疫两个方面，为新型疟疾疫苗的研究奠定了理论和实践基础。
[参考文献]
[1] The RTS，S Clinical Trials Partnership.A phase 3 trial of RTS，S/AS01 malaria vaccine in African infants[J]. N Engl J Med，2012，367（24）：2284-2295.
[2] The RTS，S Clinical Trials Partnership.First Results of Phase 3 Trial of RTS，S/AS01 Malaria Vaccine in African Children[J].N Engl J Med，2011，365（20）：1863-1875.
[3] Miao J，Li X，Liu Z，et al.Immune responses in mice induced by prime-boost schemes of the Plasmodium falciparum apical membrane antigen 1（PfAMA1）-based DNA，protein and recombinant modified vaccinia Ankara vaccines[J].Vaccine，2006，24（37-39）：6187-98.
[4] 沈燕，赵亚，黄豫晓，等.恶性疟原虫复合多表位基因的原核表达和多克隆抗体制备[J].科学技术与工程，2012，12（22）：5438-5443.
[5] Yinghui Li，Yuxiao Huang，Jiao Liang，et al.Immune responses induced in HHD mice by multiepitope HIV vaccine based on cryptic epitope modification[J].Molecular Biology Reports，2013，40（4）：2781-2787.
[6] Al-Deen FN，Ho J，Selomulya C，et al.Superparamagnetic nanoparticles for effective delivery of malaria DNA vaccine[J].Langmuir，2011，27（7）：3703-3712.
[7] Nawwab Al-Deen F，Ma C，Xiang SD，et al.On the efficacy of malaria DNA vaccination with magnetic gene vectors[J].J Control Release，2013，168（1）：10-17.
（收稿日期：2013-04-10）
[关键词] 恶性疟原虫；疫苗；多表位基因
[中图分类号] R392.1 [文献标识码] A [文章编号] 2095-0616（2013）10-26-03
疟疾是严重危害人类健康的热带传染病，在非洲仅次于HIV/AIDS，排在第2位。疟疾疫苗的研制对儿童、孕妇等高危人群的保护方面尤为重要。但是，由于疟原虫具有复杂的生活史、抗原变异等特点，疫苗的研制仍是困难重重。目前已经结束Ⅲ期临床试验的RTS，S疫苗对低龄婴儿的保护率仅为53%左右[1-2]，但这已经是疟疾疫苗研究领域非常重大的突破。在疟原虫的生活史过程中，子孢子入侵肝细胞和裂殖子入侵红细胞是两个有决定性意义的步骤，截止目前尚无一种疫苗或疫苗免疫策略可成功兼顾疟原虫红细胞内期和肝细胞内期。我们在前期构建疟原虫联合红内期和肝内期的多表位基因的基础上，构建其真核表达载体并且研究其诱导小鼠的免疫应答。本研究从体液免疫和细胞免疫水平研究该多期多表位疫苗的免疫学特性，为研究新型疟疾疫苗提供理论和实践基础。
1 材料与方法
1.1 一般材料
DNA免疫用载体质粒VR1020由美国海军医学研究所
的Stephen L.Hoffman博士惠赠。T-AMA-1和T-MEG均为本教研室制备，HHD-2小鼠由本教研室转基因动物室提供。
1.2 方法
1.2.1 VR1020/AMAMEG重组表达载体的构建 采用参考文献[3]方法，用BamHI和BgLII双酶切的真核载体VR1020，以BamHI和NdeI双酶切T-AMA-1，以NdeI和BgLII双酶切T-MEG，将三片段用T4DNA连接酶连接，转化DH5α。重组质粒VR1020 /AMAMEG采用双酶切鉴定，并送TaKaRa公司进行核苷酸序列测定。
1.2.2 VR1020/AMAMEG重组质粒的大量制备 将重组质粒VR1020/AMAMEG阳性克隆接种于卡那抗性的LB培养基中，37℃，220 rpm震荡12 h，次日1∶1000比例稀释到100 mL卡那抗性的LB培养基中，37℃，220 rpm震荡培养12 h，离心收集菌体，大提质粒试剂盒提取VR1020/AMAMEG质粒。
1.2.3 VR1020/AMAMEG重组免疫小鼠 每组5只，免疫前用0.75%戊巴比妥钠75 mg/kg腹腔麻醉。于0周，3周，6周免疫3次，每只小鼠DNA免疫量为100?g，多点肌肉注射。
1.2.4 ELISA检测抗体效价 应用文献[4]方法，简言之：用纯化的AMA融合蛋白作为包被抗原，0.1μg每孔，待检血清1∶100稀释后每孔加入100 μL，37℃放置1 h；PBS洗5次，加入1∶10000稀释的HRP-羊抗鼠IgG，37℃放置1 h；PBS洗5次，加入TMB显色，加入2M硫酸50μL/孔终止显色，OD490处测吸光度。
1.2.5 细胞因子的诱生及其测定 用RPMI-1640完全培养液将各组免疫小鼠脾细胞调整至5×106/mL，加入24孔板中培养，800 μL/孔，分别加入MEGAMA纯化蛋白10 μg/孔，对照组不加蛋白；置5% CO2孵箱中37℃培养42 h，收集培养液，5000 rpm离心5 min，取上清，-20℃冻存备检；IFN-γ及IL-2含量的测定，参照试剂盒说明书进行（夹心ELISA法）。
1.2.6 CTL杀伤实验 免疫小鼠后第12周分离免疫小鼠脾脏淋巴细胞，调整细胞浓度为1×107个/mL，置于96孔培养板中用RPMI 1640完全培养基培养，加入MEGAMA纯化蛋白至终浓度为10 μmol/L，继续培养2 d，作为效应细胞；C1R-AD细胞作为靶细胞。按不同的效靶比进行CTL杀伤实验，乳酸脱氢酶实验检测CTL的细胞毒活性，并按下面的公式计算杀伤率：细胞杀伤率=（实验组平均A值-自然释放对照组平均A值）/（最大释放对照组平均A值-自然释放对照组平均A值）×100%。
2 结果
2.1 VR1020 /AMAMEG重组载体的酶切鉴定
经BamHI和BgLII双酶切VR1020 /AMAMEG，得到1400 bp左右的片段（图1），与预期片段大小一致，测序分析显示序列与原始设计序列完全一致。
M-2000bp DNA标志物；1-VR1020/AMAMEG双酶切
2.2 VR1020 /AMAMEG免疫小鼠后抗体效价
将VR1020 /AMAMEG免疫HHD-2小鼠，ELISA测定抗血清效价在免疫6周时上升较高，到9周时达到高峰。见图2。
2.3 VR1020 /AMAMEG免疫后细胞因子诱生情况
结果见图3A，B所示，重组DNA疫苗组和VR1020对照组IFN-γ和IL-2水平均高于对照组（P<0.01），且重组DNA疫苗免疫组高于VR1020空载体组（P<0.05）；提示重组DNA疫苗能够诱导有效的细胞免疫应答。
2.4 VR1020 /AMAMEG免疫后诱导CTL杀伤情况
结果见图4所示，重组DNA疫苗组的平均杀伤活性达到46.9%，VR1020组和生理盐水组分别为18.4%和8.6%。重组DNA疫苗诱导的CTL活性在效靶比为100∶1时达到最高，为72.3%，显著高于生理盐水组（8.8%）和VR1020组（19.05%）。 3 讨论
本研究基于多期多表位的重组疟疾DNA疫苗构建和免疫学特性研究，以VR1020作为载体，以改造隐性表位为基础的多串联的CTL表位基因和疟原虫顶端膜抗原AMA-1作为目标基因片段构建重组真核表达载体。VR1020载体具有CMV的立即早期增强子/启动子复合体，在启动子与编码序列之间插入了CMV立即早期基因的第一个内含子Intron A，来自人组织凝血酶原激活物（TPA）的信号肽序列位于多克隆位点的5’端，可引导目的蛋白进行分泌表达，而且该载体是美国FDA批准的少数可以用于人体的真核表达载体之一，目前用于较多的DNA疫苗研制中[5-6]。从实验结果上看是能够诱导较高水平的抗体产生，也能够活化IL-2等的细胞因子，以及诱导CTL来杀伤相应靶细胞。该重组恶性疟原虫多期多表位真核表达载体免疫小鼠免疫学特性研究显示兼顾了体液免疫和细胞免疫两个方面，为新型疟疾疫苗的研究奠定了理论和实践基础。
[参考文献]
[1] The RTS，S Clinical Trials Partnership.A phase 3 trial of RTS，S/AS01 malaria vaccine in African infants[J]. N Engl J Med，2012，367（24）：2284-2295.
[2] The RTS，S Clinical Trials Partnership.First Results of Phase 3 Trial of RTS，S/AS01 Malaria Vaccine in African Children[J].N Engl J Med，2011，365（20）：1863-1875.
[3] Miao J，Li X，Liu Z，et al.Immune responses in mice induced by prime-boost schemes of the Plasmodium falciparum apical membrane antigen 1（PfAMA1）-based DNA，protein and recombinant modified vaccinia Ankara vaccines[J].Vaccine，2006，24（37-39）：6187-98.
[4] 沈燕，赵亚，黄豫晓，等.恶性疟原虫复合多表位基因的原核表达和多克隆抗体制备[J].科学技术与工程，2012，12（22）：5438-5443.
[5] Yinghui Li，Yuxiao Huang，Jiao Liang，et al.Immune responses induced in HHD mice by multiepitope HIV vaccine based on cryptic epitope modification[J].Molecular Biology Reports，2013，40（4）：2781-2787.
[6] Al-Deen FN，Ho J，Selomulya C，et al.Superparamagnetic nanoparticles for effective delivery of malaria DNA vaccine[J].Langmuir，2011，27（7）：3703-3712.
[7] Nawwab Al-Deen F，Ma C，Xiang SD，et al.On the efficacy of malaria DNA vaccination with magnetic gene vectors[J].J Control Release，2013，168（1）：10-17.
（收稿日期：2013-04-10）