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[摘要] 目的 探讨神经细胞黏附分子（NCAM）在乳腺癌中的表达及临床意义。 方法 应用免疫组织化学方法检测NCAM在30例乳腺癌组织、癌旁组织及30例乳腺良性病变组织中的表达情况。应用酶联免疫吸附法（ELISA）测定NCAM在30例乳腺癌患者、30例乳腺良性病变患者及30例正常人群中的血清浓度并进行统计学分析。 结果 免疫组化结果：乳腺癌组织、癌旁组织及乳腺良性病变组织中NCAM阳性率分别为26.67%、3.33%、3.33%，NCAM在癌组织中表达明显高于癌旁组织及良性病变组织（P<0.0125），乳腺癌中有神经侵袭组的NCAM 阳性率明显高于无神经侵袭组（P<0.05） 。ELISA结果：乳腺癌患者的NCAM血清浓度均显著高于良性病变组及正常人群组（P<0.05）。 结论 神经细胞黏附分子在乳腺癌的发生发展中可能起到了重要作用。NCAM的高表达对于乳腺癌的神经侵袭和转移可能很重要。
[关键词] 神经细胞黏附分子（NCAM）；乳腺癌；酶联免疫吸附法；免疫组织化学
[中图分类号] R737.9 [文献标识码] A [文章编号] 2095-0616（2014）22-24-04
乳腺癌是严重危害女性健康的恶性肿瘤，复发、转移常是其治疗失败的主要原因。因此，对乳腺癌的早期诊断、早期治疗成为提高其治疗效果的关键。周木秀等[1]发现神经周浸润与乳腺癌患者的复发及5年存活率有关，是乳腺癌一种重要的预后参数。神经细胞黏附分子（neural cell adhesion molecule，NCAM）对神经组织有亲嗜性，对胆管癌的发生、神经浸润转移有重要影响[2]。王大东等[3]发现胆管癌中肿瘤细胞神经浸润阳性与小血管、小
淋巴管的浸润呈正相关，肿瘤细胞NCAM表达阳性与神经浸润阳性呈正相关，肿瘤的恶性程度与NCAM表达呈正相关。另外一些研究发现NCAM与胃癌、涎腺腺样囊性癌等的浸润转移相关，推测肿瘤细胞表面的NCAM可能在肿瘤神经侵袭中发挥“锚定”作用[4-5]。为了了解NCAM在乳腺癌的表达情况，探讨它与乳腺癌的发生及浸润转移的关系，寻找可能的乳腺癌相关血清标志物，为乳腺癌的防治提供新思路，本研究采用免疫组织化学技术对乳腺癌组织、癌旁组织及良性乳腺病变组织中NCAM的表达进行检测，并用酶联免疫吸附法（ELISA）测定乳腺癌患者、良性乳腺病变患者及正常人群的NCAM血清浓度，对结果进行统计学分析，报道如下。
1 资料与方法
1.1 一般资料
1.1.1 免疫组化检测 所有病例均来源于深圳市宝安区松岗人民医院2009～2014年收治的乳腺疾病患者，病理资料完整。乳腺癌30例，经病理组织学确诊，均带有癌旁组织；其中活检标本12例，癌根治术标本18例；有神经侵袭的10例，无神经侵袭的20例；患者均为女性，年龄33～73岁，肿块大小3～5cm，所有患者术前未进行抗肿瘤化疗或放疗。乳腺良性病变30例，包括乳腺纤维腺瘤20例，乳腺腺病4例，囊性乳腺病6例，年龄23～65岁，平均年龄45岁。
1.1.2 酶联免疫吸附法（ELISA）检测 30例乳腺癌患者及30例乳腺良性病变患者同上所述，所有研究对象均排除妊娠、感染、肝肾功能不全、糖尿病、心功能衰竭等并发症。另外选取本院同期健康体检人员30例为正常对照组，年龄26～57岁，平均42岁。
1.2 方法
1.2.1 免疫组化检测方法 30例乳腺癌组织、癌旁组织及30例乳腺良性病变组织经10%中性福尔马林固定，石蜡包埋，常规切片，HE染色，光镜观察。之后连续切片进行免疫组化标记（S-P法），第一抗体为鼠抗人NCAM（CD56）单克隆抗体，试剂均为即用型，购自福州迈新生物技术开发有限公司。以PBS液代替一抗作阴性对照，已知NK-T细胞淋巴瘤阳性结果为阳性对照。NCAM 阳性判断标准：染色阳性信号为棕黄色，位于细胞膜或细胞浆。
1.2.2 酶联免疫吸附法（ELISA）检测方法 良性肿瘤患者及乳腺癌患者均于手术前取血，正常对照组血清于健康查体时获得。采用ELISA测定受试对象血清中NCAM浓度（试剂盒购自博士德生物公司）。试验过程严格按照试剂盒说明书操作。
1.3 统计学处理
2 结果
2.1 免疫组化分析
2.2 ELISA结果分析
3 讨论
乳腺癌是发生在乳腺的一种恶性上皮性肿瘤。乳腺并不是维持人体生命活动的重要器官，原位乳腺癌并不致命；但由于乳腺癌细胞丧失了正常细胞的特性，细胞之间连接松散，容易脱落。癌细胞一旦脱落，游离的癌细胞可以转移、扩散，从而危及生命。近年来，乳腺癌已逐渐成为威胁女性身心健康的常见肿瘤。目前，关于乳腺癌预后指标的研究已不少见，部分指标已日渐成熟并应用于临床，如ER、PR、Her-2等，但目前尚无特异性血清肿瘤标志物以监测预后。此外，由于血清取材简便易行，可以长期、动态、连续观测，因此，寻找乳腺癌相关血清特异性标志物具有重要意义。
恶性肿瘤细胞的重要生物学特性是其对周围组织的侵袭和破坏，并在远隔器官形成转移灶。其涉及肿瘤细胞与宿主间多环节、多步骤的复杂过程，包括肿瘤细胞转变，原位脱落和侵袭，内渗和播散，郁积、黏附和外渗，异位生长和增殖，其中细胞黏附参与整个过程并起重要作用，而介导细胞黏附作用的是一大类细胞黏附分子[6]。细胞黏附分子在肿瘤侵袭转移中的作用是一复杂的过程，主要是参与介导肿瘤细胞与宿主细胞及细胞外基质的相互作用，按其结构可分为5类：免疫球蛋白超家族（IgSF）、钙黏素家族（cadherins）、整合素家族（integrins）、选择素家族（selectins）以及尚未归类的一些受体家族[7-8]。IgSF是人类基因组中最大的蛋白超家族，一般IgSF可分为2组：一组类似于神经细胞黏附分子（NCAM） ，另一组类似于包括细胞间黏附分子-1（ICAM1）、血管细胞黏附分子1 （VCAM1）、L1型细胞黏附分子（L1-CAM）等的细胞黏附分子。 NCAM 是Edelman[9]首次在神经组织中提取的多肽，参与神经细胞间及神经与肌肉间突触形成，使细胞之间产生分子结合，促使细胞凝集，被认为是介导细胞与细胞黏附的非依赖钙黏附分子的代表。现已初步证明各种黏附分子的结合能在胞内启动信号的传递过程。有资料表明，由NCAM介导的信号传递在细胞生长、分化和行为方面有重要的作用，并有可能介入了经典的传导途径[10]。NCAM一向被认为具有抗侵袭转移活性[8]，而在近几年的研究中又被认为具有促进癌细胞侵袭转移的活性[11]，其作用机制尚有待进一步的研究。目前越来越多的研究发现NCAM与肿瘤的发生发展密切相关。夏鹰等[12]发现多聚唾液酸神经细胞黏附分子的表达与垂体腺瘤的大小、侵袭性、增殖指数密切相关。另有研究发现NCAM参与了恶性胶质瘤的形成[13]。还有一些报道表明，NCAM高表达易导致肾癌中枢神经系统和肾上腺转移[11]。Bockman等[14]认为神经纤维的转化生长因子（TGF）与胰腺癌细胞表面的表皮生长因子受体（EGFR）相互作用，构成神经-肿瘤之间微环境中的自分泌和（或）旁分泌环，促进肿瘤细胞的生长，减缓凋亡。介导细胞-细胞粘附的非依钙的细胞黏附分子中，NCAM是其代表分子。它和钙粘素（cadherin）都是以嗜同结合方式粘附靶细胞，即钙粘素-钙粘素，NCAM-NCAM 的方式[15] 。
我们的研究显示，NCAM在癌组织中的阳性表达率显著高于癌旁组织及良性病变组织，提示我们NCAM在乳腺癌的发生发展中可能起到了重要作用。乳腺癌组织中有神经侵袭的NCAM阳性表达率要高于无神经侵袭组，我们推测肿瘤细胞表面的NCAM可能在肿瘤神经侵袭中发挥锚定作用，此结果与孙长伏等[16]研究一致，胡振红[17]等亦发现NCAM与涎腺腺样囊性癌的发生发展具有一定的相关性，可能在其神经浸润中起介导作用。本研究中ELISA检测结果发现乳腺癌患者的NCAM血清浓度均显著高于良性病变组及正常人群组，提示我们NCAM有望成为乳腺癌相关血清标志物之一，其具体作用机制有待进一步研究。
[参考文献]
[1] 周木秀，任玉霞，代丽红.神经周浸润在乳腺癌中的意义[J].临床与实验病理学杂志，1999，15（6）：510-512.
[2] 肖广发，汤恢焕.NCAM和DPC4的表达与胆管癌神经浸润的关系[J].中国普通外科杂志，2006，15（10）：806-808.
[3] 王大东，黄志强，周宁新，等.神经细胞粘附分子在胆管癌神经浸润转移中的作用[J].中华实验外科杂志，2000，17（2）：171-172.
[4] 徐斌，居小萍，胡先贵，等.细胞粘附分子与胃癌发生及转移关系的实验研究[J].中华胃肠外科杂志， 2001，4（4）：251-253.
[5] 金善恩，王可敬，赏金标，等.神经细胞粘附分子49例涎腺腺样囊性癌表达及临床意义[J].肿瘤学杂志，2010，16（4）： 285-287.
[6] Nguyen TH. Mechanisms ofmetastasis[J ].Clin Dermatol，2004， 22（3）：209-216.
[7] Thiery JP.Cell adhesion in development：a complex signaling network[J].Curr Op in Genet Dev，2003，13（4）：365-371.
[8] Reiss K，Ludwig A，Saftig P.Breaking up the tie：disintegrin-like metalloproteinases as regulators of cell migration in inflammation and invasion [J].Pharmacol Ther， 2006，111（3）：985-1006.
[9] Edelman GM.Cell adhesion molecules[J].Science，1983， 219（4584）：450-457.
[10] Boutin C，Schmitz B，Cremer H，et al.NCAM expression induces neurogenesis in vivo[J].Eur J Neurosci，2009，30（7）：1209-1218.
[11] Daniel L，Bouvier C，Chetaille B，et al.Neural cell adhesion molecule expression in renal cell carcinomas：relation to metastatic behavior[J].Hum Pathol，2003，34（6）：528-532.
[12] 夏鹰，陈焕雄，曹作为，等.多聚唾液酸神经细胞黏附分子在垂体腺瘤中的表达及其临床意义[J].中华实验外科杂志，2010（7）： 926-927.
[13] 祝峙，王建军，李莉.神经细胞黏附分子对恶性胶质瘤细胞体外侵袭能力的影响[J].中华实验外科杂志，2001，18：62-63.
[14] Bockman DE，Chler M，Beger HG，et al.Interaction of pancreatic ductal carcinoma with nerves leads to nerve damage[J].Gastroenterology，1994，197：219-230.
[15] 王学铭.钙依粘附蛋白和神经细胞粘附分子的结构与功能[J].生命的化学，1995，15（2）：18-20.
[16] 孙长伏，王兆元，王玉新，等.涎腺腺样囊性癌嗜神经性与神经细胞粘附分子关系的研究[J].中华口腔医学杂志，1999，2（2）：22-23.
[17] 胡振红，彭琪琳，傅祖红，等.神经细胞黏附分子CD56在肺癌中的表达[J].中国医师杂志，2004，6（9）： 1208-1209.
（收稿日期：2014-09-18）
[关键词] 神经细胞黏附分子（NCAM）；乳腺癌；酶联免疫吸附法；免疫组织化学
[中图分类号] R737.9 [文献标识码] A [文章编号] 2095-0616（2014）22-24-04
乳腺癌是严重危害女性健康的恶性肿瘤，复发、转移常是其治疗失败的主要原因。因此，对乳腺癌的早期诊断、早期治疗成为提高其治疗效果的关键。周木秀等[1]发现神经周浸润与乳腺癌患者的复发及5年存活率有关，是乳腺癌一种重要的预后参数。神经细胞黏附分子（neural cell adhesion molecule，NCAM）对神经组织有亲嗜性，对胆管癌的发生、神经浸润转移有重要影响[2]。王大东等[3]发现胆管癌中肿瘤细胞神经浸润阳性与小血管、小
淋巴管的浸润呈正相关，肿瘤细胞NCAM表达阳性与神经浸润阳性呈正相关，肿瘤的恶性程度与NCAM表达呈正相关。另外一些研究发现NCAM与胃癌、涎腺腺样囊性癌等的浸润转移相关，推测肿瘤细胞表面的NCAM可能在肿瘤神经侵袭中发挥“锚定”作用[4-5]。为了了解NCAM在乳腺癌的表达情况，探讨它与乳腺癌的发生及浸润转移的关系，寻找可能的乳腺癌相关血清标志物，为乳腺癌的防治提供新思路，本研究采用免疫组织化学技术对乳腺癌组织、癌旁组织及良性乳腺病变组织中NCAM的表达进行检测，并用酶联免疫吸附法（ELISA）测定乳腺癌患者、良性乳腺病变患者及正常人群的NCAM血清浓度，对结果进行统计学分析，报道如下。
1 资料与方法
1.1 一般资料
1.1.1 免疫组化检测 所有病例均来源于深圳市宝安区松岗人民医院2009～2014年收治的乳腺疾病患者，病理资料完整。乳腺癌30例，经病理组织学确诊，均带有癌旁组织；其中活检标本12例，癌根治术标本18例；有神经侵袭的10例，无神经侵袭的20例；患者均为女性，年龄33～73岁，肿块大小3～5cm，所有患者术前未进行抗肿瘤化疗或放疗。乳腺良性病变30例，包括乳腺纤维腺瘤20例，乳腺腺病4例，囊性乳腺病6例，年龄23～65岁，平均年龄45岁。
1.1.2 酶联免疫吸附法（ELISA）检测 30例乳腺癌患者及30例乳腺良性病变患者同上所述，所有研究对象均排除妊娠、感染、肝肾功能不全、糖尿病、心功能衰竭等并发症。另外选取本院同期健康体检人员30例为正常对照组，年龄26～57岁，平均42岁。
1.2 方法
1.2.1 免疫组化检测方法 30例乳腺癌组织、癌旁组织及30例乳腺良性病变组织经10%中性福尔马林固定，石蜡包埋，常规切片，HE染色，光镜观察。之后连续切片进行免疫组化标记（S-P法），第一抗体为鼠抗人NCAM（CD56）单克隆抗体，试剂均为即用型，购自福州迈新生物技术开发有限公司。以PBS液代替一抗作阴性对照，已知NK-T细胞淋巴瘤阳性结果为阳性对照。NCAM 阳性判断标准：染色阳性信号为棕黄色，位于细胞膜或细胞浆。
1.2.2 酶联免疫吸附法（ELISA）检测方法 良性肿瘤患者及乳腺癌患者均于手术前取血，正常对照组血清于健康查体时获得。采用ELISA测定受试对象血清中NCAM浓度（试剂盒购自博士德生物公司）。试验过程严格按照试剂盒说明书操作。
1.3 统计学处理
2 结果
2.1 免疫组化分析
2.2 ELISA结果分析
3 讨论
乳腺癌是发生在乳腺的一种恶性上皮性肿瘤。乳腺并不是维持人体生命活动的重要器官，原位乳腺癌并不致命；但由于乳腺癌细胞丧失了正常细胞的特性，细胞之间连接松散，容易脱落。癌细胞一旦脱落，游离的癌细胞可以转移、扩散，从而危及生命。近年来，乳腺癌已逐渐成为威胁女性身心健康的常见肿瘤。目前，关于乳腺癌预后指标的研究已不少见，部分指标已日渐成熟并应用于临床，如ER、PR、Her-2等，但目前尚无特异性血清肿瘤标志物以监测预后。此外，由于血清取材简便易行，可以长期、动态、连续观测，因此，寻找乳腺癌相关血清特异性标志物具有重要意义。
恶性肿瘤细胞的重要生物学特性是其对周围组织的侵袭和破坏，并在远隔器官形成转移灶。其涉及肿瘤细胞与宿主间多环节、多步骤的复杂过程，包括肿瘤细胞转变，原位脱落和侵袭，内渗和播散，郁积、黏附和外渗，异位生长和增殖，其中细胞黏附参与整个过程并起重要作用，而介导细胞黏附作用的是一大类细胞黏附分子[6]。细胞黏附分子在肿瘤侵袭转移中的作用是一复杂的过程，主要是参与介导肿瘤细胞与宿主细胞及细胞外基质的相互作用，按其结构可分为5类：免疫球蛋白超家族（IgSF）、钙黏素家族（cadherins）、整合素家族（integrins）、选择素家族（selectins）以及尚未归类的一些受体家族[7-8]。IgSF是人类基因组中最大的蛋白超家族，一般IgSF可分为2组：一组类似于神经细胞黏附分子（NCAM） ，另一组类似于包括细胞间黏附分子-1（ICAM1）、血管细胞黏附分子1 （VCAM1）、L1型细胞黏附分子（L1-CAM）等的细胞黏附分子。 NCAM 是Edelman[9]首次在神经组织中提取的多肽，参与神经细胞间及神经与肌肉间突触形成，使细胞之间产生分子结合，促使细胞凝集，被认为是介导细胞与细胞黏附的非依赖钙黏附分子的代表。现已初步证明各种黏附分子的结合能在胞内启动信号的传递过程。有资料表明，由NCAM介导的信号传递在细胞生长、分化和行为方面有重要的作用，并有可能介入了经典的传导途径[10]。NCAM一向被认为具有抗侵袭转移活性[8]，而在近几年的研究中又被认为具有促进癌细胞侵袭转移的活性[11]，其作用机制尚有待进一步的研究。目前越来越多的研究发现NCAM与肿瘤的发生发展密切相关。夏鹰等[12]发现多聚唾液酸神经细胞黏附分子的表达与垂体腺瘤的大小、侵袭性、增殖指数密切相关。另有研究发现NCAM参与了恶性胶质瘤的形成[13]。还有一些报道表明，NCAM高表达易导致肾癌中枢神经系统和肾上腺转移[11]。Bockman等[14]认为神经纤维的转化生长因子（TGF）与胰腺癌细胞表面的表皮生长因子受体（EGFR）相互作用，构成神经-肿瘤之间微环境中的自分泌和（或）旁分泌环，促进肿瘤细胞的生长，减缓凋亡。介导细胞-细胞粘附的非依钙的细胞黏附分子中，NCAM是其代表分子。它和钙粘素（cadherin）都是以嗜同结合方式粘附靶细胞，即钙粘素-钙粘素，NCAM-NCAM 的方式[15] 。
我们的研究显示，NCAM在癌组织中的阳性表达率显著高于癌旁组织及良性病变组织，提示我们NCAM在乳腺癌的发生发展中可能起到了重要作用。乳腺癌组织中有神经侵袭的NCAM阳性表达率要高于无神经侵袭组，我们推测肿瘤细胞表面的NCAM可能在肿瘤神经侵袭中发挥锚定作用，此结果与孙长伏等[16]研究一致，胡振红[17]等亦发现NCAM与涎腺腺样囊性癌的发生发展具有一定的相关性，可能在其神经浸润中起介导作用。本研究中ELISA检测结果发现乳腺癌患者的NCAM血清浓度均显著高于良性病变组及正常人群组，提示我们NCAM有望成为乳腺癌相关血清标志物之一，其具体作用机制有待进一步研究。
[参考文献]
[1] 周木秀，任玉霞，代丽红.神经周浸润在乳腺癌中的意义[J].临床与实验病理学杂志，1999，15（6）：510-512.
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[9] Edelman GM.Cell adhesion molecules[J].Science，1983， 219（4584）：450-457.
[10] Boutin C，Schmitz B，Cremer H，et al.NCAM expression induces neurogenesis in vivo[J].Eur J Neurosci，2009，30（7）：1209-1218.
[11] Daniel L，Bouvier C，Chetaille B，et al.Neural cell adhesion molecule expression in renal cell carcinomas：relation to metastatic behavior[J].Hum Pathol，2003，34（6）：528-532.
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[13] 祝峙，王建军，李莉.神经细胞黏附分子对恶性胶质瘤细胞体外侵袭能力的影响[J].中华实验外科杂志，2001，18：62-63.
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[15] 王学铭.钙依粘附蛋白和神经细胞粘附分子的结构与功能[J].生命的化学，1995，15（2）：18-20.
[16] 孙长伏，王兆元，王玉新，等.涎腺腺样囊性癌嗜神经性与神经细胞粘附分子关系的研究[J].中华口腔医学杂志，1999，2（2）：22-23.
[17] 胡振红，彭琪琳，傅祖红，等.神经细胞黏附分子CD56在肺癌中的表达[J].中国医师杂志，2004，6（9）： 1208-1209.
（收稿日期：2014-09-18）