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【摘要】 目的：通过联合应用PD0166285和阿霉素，观察其对急性白血病细胞HL-60的作用，探讨其可能的作用机制。方法：通过MTT法检测药物对HL-60的生长抑制作用，流式细胞术检测其凋亡作用，Western bolt检测凋亡相关蛋白caspase-3和PARP的表达情况。结果：PD0166285联合阿霉素对HL-60细胞的抑制作用和促凋亡作用明显增强，同时凋亡相关蛋白caspase-3和PARP的剪切增加。结论：PD0166285能够增强阿霉素对HL-60细胞的生长抑制并促进其凋亡，可能通过caspase依赖性凋亡途径发挥作用。
【关键词】 PD0166285； ADM； HL-60； 凋亡
【Abstract】 Objective：Through the combined use of PD0166285 and adriamycin，to observe its effect on acute leukemia cells HL-60，and to explore its possible mechanism.Method：MTT method was used to detect the inhibitory effect of drugs on the growth of HL-60，flow cytometry was used to detect the apoptosis，Western bolt was used to detect the expression of apoptosis related protein caspase-3 and PARP.Result：The inhibitory effect and apoptosis of PD0166285 combined with adriamycin on HL-60 cells was significantly enhanced，and the shear of apoptosis related protein caspase-3 and PARP increased.Conclusion：PD0166285 can enhance the growth inhibition and apoptosis of HL-60 cells，which may play a role in caspase dependent apoptosis pathway.
【Key words】 PD0166285； ADM； HL-60； Apoptosis
First-author’s address：The First Hospital Affiliated to Jiamusi University，Jiamusi 154003，China
doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2016.36.005
急性白血病（AL）是一種造血干祖细胞的恶性克隆性疾病[1]，其治疗包括联合化疗、促分化、促凋亡治疗和造血干细胞移植，其中联合化疗是主要方法[2]。阿霉素（ADM）作为一种蒽环类抗肿瘤药物[3]，在白血病的治疗中应用已久，但由于其心脏毒性、骨髓抑制等不良反应较多且易产生多药耐药，限制了其作为抗肿瘤药物的进一步应用[4]。目前许多研究表明，一些参与细胞周期调控的分子已成为治疗肿瘤的重要靶点[5-6]。Wee1蛋白激酶作为一种细胞周期检查点激酶，是调控细胞从G2期到M期的关键靶点[7-8]。新近研究发现抑制Wee1可以导致细胞周期相关激酶活性的上调，促使受损伤细胞跨过G2/M期检查点，损伤的DNA无法完成修复便直接进入有丝分裂期，导致细胞有丝分裂灾难和细胞凋亡甚至死亡等事件的发生，表现出抗肿瘤的生物活性[9-10]。目前已有研究发现，PD0166285作为一种Wee1蛋白激酶抑制剂可协同化疗或放疗更好起到抗肿瘤作用[11]。笔者希望通过体外联合使用PD0166285与ADM，观察其对急性白血病细胞HL-60的作用，进而探讨PD0166285联合ADM抗HL-60细胞的可能机制，为临床联合使用PD0166285与ADM提供实验基础和理论依据，现报告如下。
1 材料与方法
1.1 药物和试剂 急性白血病细胞HL-60（上海子实生物公司），PD0166285（美国Selleck公司），阿霉素（美国Sigma公司），MTT（上海碧云天生物公司），兔抗人PARP、兔抗人caspase-3、兔抗人β-actin单克隆抗体、HRP标记抗兔二抗（北京中杉公司）；其余试剂均为分析纯。流式细胞仪（美国Becton Dikison公司），Annexin-V-FITC/PI细胞凋亡试剂盒（北京嘉美纽诺生物公司）。
1.2 MTT法测定PD0166285及ADM单用/联用对HL-60细胞的抑制作用 取对数生长期的HL-60细胞，按照2.0×105个/mL的细胞密度铺于96孔板中，每孔100 ?L细胞悬液，加入不同浓度的PD0166285和/或ADM。每个浓度设置三个复孔，同时用RPMI1640替代药物作为对照孔。将铺好的96孔板于细胞培养箱中孵育48 h后向每孔加入10 ?L的MTT溶液，继续孵育1 h后离心弃上清液，加入50 ?L DMSO，振荡溶解结晶后置酶标仪上490 nm波长测吸光度值（OD值），计算抑制率，抑制率（%）=（1-药物组OD值/对照组OD值）×100%。
1.3 Annexin V-FITC/PI细胞凋亡试剂盒法检测细胞调亡 收集药物处理后的细胞，PBS洗二次，4 ℃离心去上清液。加入50 ?L的结合缓冲液，再加入5 ?L Annexin V-FITC，混匀后室温避光孵育15 min。再加入10 ?L PI，孵育5 min后迅速上机完成凋亡检测。细胞凋亡率为Annexin V-FITC+/PI-及Annexin V-FITC+/PI+的百分比之和。 1.4 Western bolt检测caspase-3和PARP的表达 收集不同浓度药物作用后的细胞，细胞裂解液提取总蛋白，BCA法测定蛋白浓度，按50 μg体系加样，垂直电泳，100 V电泳转膜2 h，封闭1 h，加入一抗孵育24 h，二抗孵育1 h，加入ECL发光液，Tanon 5200采集图像，对结果进行灰度扫描。
1.5 统计学处理 采用SPSS 22.0软件对所得数据进行统计分析，计量资料用（x±s）表示，比较采用t检验，P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 MTT法测定PD0166285及ADM单用/联用对HL-60细胞的抑制作用 将HL-60细胞培养在不同浓度PD0166285和/或ADM中，MTT法测定抑制率。单独用药结果显示，PD0166285、ADM对HL-60細胞均有不同程度的抑制作用，并呈明显的剂量—效应关系。PD0166285作用于HL-60细胞48 h的IC50为1 μm；ADM作用于HL-60细胞48 h的IC50为0.65 μm。联合用药结果显示，PD0166285联合ADM增强了对HL-60细胞的生长抑制作用，单用0.1、0.5、1.0 ?m的ADM作用于HL-60细胞48 h的抑制率分别为（31.23±0.75）%、（49.73±0.61）%、（62.66±0.07）%，而联用0.50 ?m PD0166285后，抑制率增加为（48.56±0.05）%、（64.45±0.13）%、（79.73±0.18）%，差异均有统计学意义（P<0.05）。见表1。
2.2 PD0166285和/或ADM对HL-60细胞凋亡的影响 HL-60细胞处理后凋亡检测结果显示，单独用ADM（0.1 ?m，48 h）作用于HL-60细胞凋亡率为（25.27±0.34）%，单独用PD0166285（1 ?m，48 h）处理凋亡率为（23.15±1.03）%，当PD0166285（1 ?m）联合ADM（0.1 ?m）作用时凋亡率则达到（56.21±1.64）%，差异有统计学意义（P<0.05）。见图1。
2.3 PD0166285联合ADM对HL-60细胞凋亡蛋白的影响 将HL-60细胞与不同浓度的ADM及PD0166285联合作用48 h，提取蛋白，进行Western blot检测相关蛋白的表达，第1～6条泳道分别代表空白对照组、ADM 0.1 ?m组、ADM 0.5 ?m组、PD0166285 0.5 ?m组、PD0166285+ADM 0.1 ?m组、PD0166285+ADM 0.5 ?m组，ADM作用于HL-60细胞48 h后，在药物浓度0.5 ?m时caspase-3和PARP发生剪切，细胞发生凋亡，经PD0166285（0.5 ?m）和ADM联合作用后，在ADM药物浓度为0.1 ?m时caspase-3和PARP即发生剪切。见图2。
3 讨论
Wee1蛋白激酶是一种细胞周期检查点激酶，在调控细胞从G2期到M期的过渡中发挥重要作用。当细胞DNA因各种原因受到损伤时，活化的Wee1磷酸化Cdc2的Tyr15位点而使其失活，阻止CDK1-cyclinB复合物结合活化，阻止细胞进入M期，从而延迟有丝分裂[12]，促进DNA损伤的修复以及保证细胞DNA复制的完成，以避免异常的DNA进入有丝分裂期导致有丝分裂灾难甚至发生调亡[13]。目前在许多恶性肿瘤中都检测到了Wee1的过表达，特别是在p53突变或缺失型的肿瘤中更明显[14-15]，国内学者经实验初步证明Wee1在急性白血病细胞株中存在高表达[16]。此外，Wang等[17]发现，在肿瘤细胞中Wee1的过表达能够对抗DNA损伤后引起的凋亡，使受损伤细胞得到修复并对放化疗不敏感[8]。
根据Wee1在细胞周期中的作用及其在一些肿瘤中过表达，提示可以通过抑制Wee1来抑制肿瘤的发生和发展[18]。科研人员在过去的十多年中研发出来了多种Wee1小分子抑制剂，如PD0166285、PD0407824及MK-1775等[19]，在不同的实验中表现出了抗肿瘤作用[20]。本实验表明当Wee1蛋白激酶抑制剂PD0166285联合ADM应用时，能够明显增强ADM对急性白血病细胞HL-60的增殖抑制和促凋亡作用，笔者考虑当Wee1蛋白激酶受到抑制时，ADM造成的细胞DNA损伤无法得到修复，大量受损伤细胞未完成修复便进入M期，DNA损伤增加，进而出现有丝分裂灾难，导致caspase-3的激活和PARP的裂解增加，通过caspase依赖性凋亡途径诱导细胞凋亡。但是，由于caspase依赖性凋亡途径又可分为由死亡受体介导的外源性途径和由线粒体和内质网介导的内源性途径[21]，并且是否涉及非caspase依赖途径的参与尚不清楚，PD0166285增强ADM诱导HL-60细胞凋亡的具体机制有待进一步深入研究。由于Wee1激酶抑制剂充分发挥抗白血病细胞作用需要建立在细胞DNA受损伤的基础上，因此Wee1激酶抑制剂与化疗、放疗等损伤细胞的治疗方法联合使用可能是比较理想的方案。
参考文献
[1]黄晓军，黄河.血液内科学[M].2版.北京：人民卫生出版社，2014：9-18.
[2]王建祥.急性白血病治疗的探索[J].循证医学，2009，9（5）：260-262.
[3]刘晓，邵方元，陈宏远.阿霉素抗肿瘤分子机制的研究进展[J].中国医药生物技术，2012，7（5）：373-375.
[4]朱梁，裴茂炜.阿霉素心脏毒性发生机制及其防治的研究进展[J].健康研究，2013，33（2）：102-105.
[5]詹启敏，陈杰.细胞周期与肿瘤转化医学[J].中国肿瘤临床，2014，41（1）：1-7.
[6]何海涛，李惠民.急性髓系白血病靶向治疗的研究进展[J].中国实验血液学杂志，2016，24（1）：245-249. [7]胡金龙，刘慧婷，梁可可.Wee1蛋白激酶的研究及进展[J].中国当代医药，2011，18（10）：25-26.
[8]刘斌.WEE1，组蛋白与肿瘤[J].中南大学学报（医学版），2015，40（7）：806-810.
[9] Mackintosh C，Garcia-Dominguez D J，Ordonez J L，et al.
WEE1 accumulation and deregulation of S-phase proteins mediate MLN4924 potent inhibitory effect on Ewing sarcoma cells[J].Oncogene，2013，32（11）：1441-1451.
[10] Creevey L，Ryan J，Harvey H，et al.MicroRNA-497 increases apoptosis in MYCN amplified neuroblastoma cells by targeting the key cell cycle regulator WEE1[J].Molecular Cancer，2013，12（1）：1-12.
[11] Wang Y，Li J，Booher R N，et al.Radiosensitization of p53 mutant cells by PD0166285，a novel G（2） checkpoint abrogator[J].Cancer Research，2001，61（22）：8211-8217.
[12]胡兆华，阙祥勇，柳长柏，等.Wee1蛋白激酶与肿瘤相关性的研究进展[J].广东医学，2014，35（8）：1277-1279.
[13] Adhikari D，Liu K.The regulation of Maturation Promoting Factor during prophase I arrest and meiotic entry in mammalian oocytes[J].Molecular & Cellular Endocrinology，2013，382（1）：480-487.
[14] De Witt Hamer P C，Mir S E，Noske D，et al.WEE1 kinase targeting combined with DNA-damaging cancer therapy catalyzes mitotic catastrophe[J].Clin Cancer Res，2011，17（13）：4200-4207.
[15]呂慧，杨玉秀，张立达，等.WEE1与肝癌的关系[J].世界华人消化杂志，2011，19（14）：1515-1519.
[16]齐文秀.MK-1775与帕比司他协同杀伤急性髓系白血病细胞的机制研究[D].长春：吉林大学，2015.
[17] Wang F，Zhu Y，Huang Y，et al.Transcriptional repression of WEE1 by Kruppel-like factor 2 is involved in DNA damage-induced apoptosis[J].Oncogene，2005，24（24）：3875-3885.
[18] Posthumadeboer J，Würdinger T，Graat H C，et al.WEEl inhibition sensitizes osteosarcoma to radiotherapy[J].BMC Cancer，2011，11（1）：894-894.
[19] Sarcar B，Kahali S，Prabhu A H，et al.Targeting radiation-induced G（2） checkpoint activation with the Wee-1 inhibitor MK-1775 in glioblastoma cell lines[J].Mol Cancer Ther，2011，10（12）：2405-2414.
[20]隋旭，韩斌，杨梦莉，等.WEE1激酶及其抑制剂在抗肿瘤治疗中的应用进展[J].现代生物医学进展，2016，16（13）：2589-2592.
[21]李敏，林俊，LI Min，等.细胞凋亡途径及其机制[J].国际妇产科学杂志，2014，41（2）：103-107.
（收稿日期：2016-10-14） （本文编辑：张爽）
【关键词】 PD0166285； ADM； HL-60； 凋亡
【Abstract】 Objective：Through the combined use of PD0166285 and adriamycin，to observe its effect on acute leukemia cells HL-60，and to explore its possible mechanism.Method：MTT method was used to detect the inhibitory effect of drugs on the growth of HL-60，flow cytometry was used to detect the apoptosis，Western bolt was used to detect the expression of apoptosis related protein caspase-3 and PARP.Result：The inhibitory effect and apoptosis of PD0166285 combined with adriamycin on HL-60 cells was significantly enhanced，and the shear of apoptosis related protein caspase-3 and PARP increased.Conclusion：PD0166285 can enhance the growth inhibition and apoptosis of HL-60 cells，which may play a role in caspase dependent apoptosis pathway.
【Key words】 PD0166285； ADM； HL-60； Apoptosis
First-author’s address：The First Hospital Affiliated to Jiamusi University，Jiamusi 154003，China
doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2016.36.005
急性白血病（AL）是一種造血干祖细胞的恶性克隆性疾病[1]，其治疗包括联合化疗、促分化、促凋亡治疗和造血干细胞移植，其中联合化疗是主要方法[2]。阿霉素（ADM）作为一种蒽环类抗肿瘤药物[3]，在白血病的治疗中应用已久，但由于其心脏毒性、骨髓抑制等不良反应较多且易产生多药耐药，限制了其作为抗肿瘤药物的进一步应用[4]。目前许多研究表明，一些参与细胞周期调控的分子已成为治疗肿瘤的重要靶点[5-6]。Wee1蛋白激酶作为一种细胞周期检查点激酶，是调控细胞从G2期到M期的关键靶点[7-8]。新近研究发现抑制Wee1可以导致细胞周期相关激酶活性的上调，促使受损伤细胞跨过G2/M期检查点，损伤的DNA无法完成修复便直接进入有丝分裂期，导致细胞有丝分裂灾难和细胞凋亡甚至死亡等事件的发生，表现出抗肿瘤的生物活性[9-10]。目前已有研究发现，PD0166285作为一种Wee1蛋白激酶抑制剂可协同化疗或放疗更好起到抗肿瘤作用[11]。笔者希望通过体外联合使用PD0166285与ADM，观察其对急性白血病细胞HL-60的作用，进而探讨PD0166285联合ADM抗HL-60细胞的可能机制，为临床联合使用PD0166285与ADM提供实验基础和理论依据，现报告如下。
1 材料与方法
1.1 药物和试剂 急性白血病细胞HL-60（上海子实生物公司），PD0166285（美国Selleck公司），阿霉素（美国Sigma公司），MTT（上海碧云天生物公司），兔抗人PARP、兔抗人caspase-3、兔抗人β-actin单克隆抗体、HRP标记抗兔二抗（北京中杉公司）；其余试剂均为分析纯。流式细胞仪（美国Becton Dikison公司），Annexin-V-FITC/PI细胞凋亡试剂盒（北京嘉美纽诺生物公司）。
1.2 MTT法测定PD0166285及ADM单用/联用对HL-60细胞的抑制作用 取对数生长期的HL-60细胞，按照2.0×105个/mL的细胞密度铺于96孔板中，每孔100 ?L细胞悬液，加入不同浓度的PD0166285和/或ADM。每个浓度设置三个复孔，同时用RPMI1640替代药物作为对照孔。将铺好的96孔板于细胞培养箱中孵育48 h后向每孔加入10 ?L的MTT溶液，继续孵育1 h后离心弃上清液，加入50 ?L DMSO，振荡溶解结晶后置酶标仪上490 nm波长测吸光度值（OD值），计算抑制率，抑制率（%）=（1-药物组OD值/对照组OD值）×100%。
1.3 Annexin V-FITC/PI细胞凋亡试剂盒法检测细胞调亡 收集药物处理后的细胞，PBS洗二次，4 ℃离心去上清液。加入50 ?L的结合缓冲液，再加入5 ?L Annexin V-FITC，混匀后室温避光孵育15 min。再加入10 ?L PI，孵育5 min后迅速上机完成凋亡检测。细胞凋亡率为Annexin V-FITC+/PI-及Annexin V-FITC+/PI+的百分比之和。 1.4 Western bolt检测caspase-3和PARP的表达 收集不同浓度药物作用后的细胞，细胞裂解液提取总蛋白，BCA法测定蛋白浓度，按50 μg体系加样，垂直电泳，100 V电泳转膜2 h，封闭1 h，加入一抗孵育24 h，二抗孵育1 h，加入ECL发光液，Tanon 5200采集图像，对结果进行灰度扫描。
1.5 统计学处理 采用SPSS 22.0软件对所得数据进行统计分析，计量资料用（x±s）表示，比较采用t检验，P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 MTT法测定PD0166285及ADM单用/联用对HL-60细胞的抑制作用 将HL-60细胞培养在不同浓度PD0166285和/或ADM中，MTT法测定抑制率。单独用药结果显示，PD0166285、ADM对HL-60細胞均有不同程度的抑制作用，并呈明显的剂量—效应关系。PD0166285作用于HL-60细胞48 h的IC50为1 μm；ADM作用于HL-60细胞48 h的IC50为0.65 μm。联合用药结果显示，PD0166285联合ADM增强了对HL-60细胞的生长抑制作用，单用0.1、0.5、1.0 ?m的ADM作用于HL-60细胞48 h的抑制率分别为（31.23±0.75）%、（49.73±0.61）%、（62.66±0.07）%，而联用0.50 ?m PD0166285后，抑制率增加为（48.56±0.05）%、（64.45±0.13）%、（79.73±0.18）%，差异均有统计学意义（P<0.05）。见表1。
2.2 PD0166285和/或ADM对HL-60细胞凋亡的影响 HL-60细胞处理后凋亡检测结果显示，单独用ADM（0.1 ?m，48 h）作用于HL-60细胞凋亡率为（25.27±0.34）%，单独用PD0166285（1 ?m，48 h）处理凋亡率为（23.15±1.03）%，当PD0166285（1 ?m）联合ADM（0.1 ?m）作用时凋亡率则达到（56.21±1.64）%，差异有统计学意义（P<0.05）。见图1。
2.3 PD0166285联合ADM对HL-60细胞凋亡蛋白的影响 将HL-60细胞与不同浓度的ADM及PD0166285联合作用48 h，提取蛋白，进行Western blot检测相关蛋白的表达，第1～6条泳道分别代表空白对照组、ADM 0.1 ?m组、ADM 0.5 ?m组、PD0166285 0.5 ?m组、PD0166285+ADM 0.1 ?m组、PD0166285+ADM 0.5 ?m组，ADM作用于HL-60细胞48 h后，在药物浓度0.5 ?m时caspase-3和PARP发生剪切，细胞发生凋亡，经PD0166285（0.5 ?m）和ADM联合作用后，在ADM药物浓度为0.1 ?m时caspase-3和PARP即发生剪切。见图2。
3 讨论
Wee1蛋白激酶是一种细胞周期检查点激酶，在调控细胞从G2期到M期的过渡中发挥重要作用。当细胞DNA因各种原因受到损伤时，活化的Wee1磷酸化Cdc2的Tyr15位点而使其失活，阻止CDK1-cyclinB复合物结合活化，阻止细胞进入M期，从而延迟有丝分裂[12]，促进DNA损伤的修复以及保证细胞DNA复制的完成，以避免异常的DNA进入有丝分裂期导致有丝分裂灾难甚至发生调亡[13]。目前在许多恶性肿瘤中都检测到了Wee1的过表达，特别是在p53突变或缺失型的肿瘤中更明显[14-15]，国内学者经实验初步证明Wee1在急性白血病细胞株中存在高表达[16]。此外，Wang等[17]发现，在肿瘤细胞中Wee1的过表达能够对抗DNA损伤后引起的凋亡，使受损伤细胞得到修复并对放化疗不敏感[8]。
根据Wee1在细胞周期中的作用及其在一些肿瘤中过表达，提示可以通过抑制Wee1来抑制肿瘤的发生和发展[18]。科研人员在过去的十多年中研发出来了多种Wee1小分子抑制剂，如PD0166285、PD0407824及MK-1775等[19]，在不同的实验中表现出了抗肿瘤作用[20]。本实验表明当Wee1蛋白激酶抑制剂PD0166285联合ADM应用时，能够明显增强ADM对急性白血病细胞HL-60的增殖抑制和促凋亡作用，笔者考虑当Wee1蛋白激酶受到抑制时，ADM造成的细胞DNA损伤无法得到修复，大量受损伤细胞未完成修复便进入M期，DNA损伤增加，进而出现有丝分裂灾难，导致caspase-3的激活和PARP的裂解增加，通过caspase依赖性凋亡途径诱导细胞凋亡。但是，由于caspase依赖性凋亡途径又可分为由死亡受体介导的外源性途径和由线粒体和内质网介导的内源性途径[21]，并且是否涉及非caspase依赖途径的参与尚不清楚，PD0166285增强ADM诱导HL-60细胞凋亡的具体机制有待进一步深入研究。由于Wee1激酶抑制剂充分发挥抗白血病细胞作用需要建立在细胞DNA受损伤的基础上，因此Wee1激酶抑制剂与化疗、放疗等损伤细胞的治疗方法联合使用可能是比较理想的方案。
参考文献
[1]黄晓军，黄河.血液内科学[M].2版.北京：人民卫生出版社，2014：9-18.
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[8]刘斌.WEE1，组蛋白与肿瘤[J].中南大学学报（医学版），2015，40（7）：806-810.
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[11] Wang Y，Li J，Booher R N，et al.Radiosensitization of p53 mutant cells by PD0166285，a novel G（2） checkpoint abrogator[J].Cancer Research，2001，61（22）：8211-8217.
[12]胡兆华，阙祥勇，柳长柏，等.Wee1蛋白激酶与肿瘤相关性的研究进展[J].广东医学，2014，35（8）：1277-1279.
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[14] De Witt Hamer P C，Mir S E，Noske D，et al.WEE1 kinase targeting combined with DNA-damaging cancer therapy catalyzes mitotic catastrophe[J].Clin Cancer Res，2011，17（13）：4200-4207.
[15]呂慧，杨玉秀，张立达，等.WEE1与肝癌的关系[J].世界华人消化杂志，2011，19（14）：1515-1519.
[16]齐文秀.MK-1775与帕比司他协同杀伤急性髓系白血病细胞的机制研究[D].长春：吉林大学，2015.
[17] Wang F，Zhu Y，Huang Y，et al.Transcriptional repression of WEE1 by Kruppel-like factor 2 is involved in DNA damage-induced apoptosis[J].Oncogene，2005，24（24）：3875-3885.
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[19] Sarcar B，Kahali S，Prabhu A H，et al.Targeting radiation-induced G（2） checkpoint activation with the Wee-1 inhibitor MK-1775 in glioblastoma cell lines[J].Mol Cancer Ther，2011，10（12）：2405-2414.
[20]隋旭，韩斌，杨梦莉，等.WEE1激酶及其抑制剂在抗肿瘤治疗中的应用进展[J].现代生物医学进展，2016，16（13）：2589-2592.
[21]李敏，林俊，LI Min，等.细胞凋亡途径及其机制[J].国际妇产科学杂志，2014，41（2）：103-107.
（收稿日期：2016-10-14） （本文编辑：张爽）