论文部分内容阅读
摘要：目的：观察氯沙坦对正常家兔循环及不同组织中不同亚型AngII受体mRNA表达的影响，探讨氯沙坦对正常家兔循环及不同组织RAS系统的影响。方法：新西兰大耳白家兔18只，随机分为氯沙坦组及盐水对照组，氯沙坦组予15mg.Kg-1.d-1灌胃法饲养，对照组予等量生理盐水10ml饲养，4周后用RT-PCR法测定心房、心室、胸主动脉、肾脏组织AT1、AT2、AT4 mRNA表达水平。结果：AT1受体mRNA在肾脏的表达量最多，其次是心房组织，在动脉及心室组织中表达较低。使用氯沙坦后，肾脏、心房组织AT1受体明显下调，与对照组比较，两组P<0.001，均有显著统计学差异；动脉组织AT1受体表达也有下调，但与对照组比较，无统计学差异，心室AT1受体表达略有上升，但与对照组比较也无统计学差异。在4个器官中均未检测到AT2受体的表达。AT4受体在肾脏组织表达最多，其次是胸主动脉，心房及心室含量较低，氯沙坦对AT4受体mRNA的表达无明显统计学差异。 结论：AT1、AT4受体mRNA在肾脏组织表达量最多，提示肾脏可能是RAS系统作用的主要效应器官。氯沙坦明显下调肾脏、心房组织AT1受体mRNA的表达，提示肾脏、心房组织可能为ARB作用的主要靶器官，氯沙坦对AT4受体mRNA的表达无明显影响。
关键词 ：氯沙坦；AT1受体；AT2受体；AT4受体
AngII是RAS系统中最为重要的血管活性肽，AngII主要通过与特异的细胞膜受体发挥作用，目前已知的AngII受体有四种亚型，分别是血管紧张素1型（Angiotensin type1 AT1）、血管紧张素2型（Angiotensin type2 AT2）、血管紧张素3型（Angiotensin type1 AT3）、血管紧张素4型（Angiotensin type4 AT4）受体，近年，众多研究[1-4]发现长期服用ARB类药物后，可升高循环中AngII水平，但对不同组织AngII受体表达的影响研究较少，尤其ARB类药物对AT4受体表达的影响目前尚无报道。
本试验观察ARB类药物氯沙坦对正常家兔循环中、以及4个重要器官（心房、心室、胸主动脉、肾脏）不同亚型AngII受体（AT1、AT2、AT4）表达水平的影响，旨在探讨氯沙对循环及不同靶器官的生物学效应。
新西兰大耳白家兔18只，雌=8只，雄=10只，5-6月龄，体重2.5～3.5Kg，随机分为氯沙坦组、盐水对照。氯沙坦组以氯沙坦15mg. kg-1.d-1，研成粉末溶于10ml生理盐水，灌胃法饲养四周，对照组等量生理盐水10ml灌胃法饲养四周，每周给家兔称重，调整氯沙坦用量。
3、标本的采集和处理
3%戊巴比妥钠（30mg/Kg）耳缘静脉麻醉后，迅速开胸取腔静脉血、置入抗凝剂中上下颠倒混匀，待测AngII、ALD。取心脏、胸主动脉、肾脏，分离心房及心室，分别用冰生理盐水洗净，取>200mg组织称重，液氮保存待测组织。
5、统计学处理
各项观察指标均以均数±标准差表示，不同组织间比较用方差分析，各组织对照组与氯沙坦组比较用t检验，统计学软件SPSS11.5进行统计学处理，P<0.05为有统计学差异。
结果
1、氯沙坦对AT1受体mRNA表达的影响
正常家兔的AT1受体mRNA在不同组织的表达量不同。肾脏组织AT1受体mRNA 表达量最多，与心房、心室、动脉组织比较，P均<0.001，有显著统计学差异；其次是心房组织AT1受体mRNA表达量较多，与心室、动脉组织比较，P<0.001，有显著统计学差异。而心室与动脉组织AT1受体表达量偏低，两者比较无明显统计学差异。使用氯沙坦后，肾脏组织、心房组织AT1受体mRNA表达量均明显下调，两种组织对照组与氯沙坦组比较，P<0.001，均有显著统计学差异。而动脉组织AT1受体表达也有下调，但与对照组比较，P>0.05，无统计学差异；心室组织，氯沙坦组AT1受体mRNAl略有升高，但与对照组比较，P=0.094（P>0.05），无明显统计学差异。
2、氯沙坦对不同组织AT2受体mRNA表达
3、氯沙坦对不同组织AT4受体mRNA表达
本试验观察到，正常家兔AT4受体mRNA在肾脏表达量最高，与心房、心室、动脉组织比较，P<0.001，有显著统计学差异；其次是动脉组织含量较多，与心房、心室组织比较，P<0.001，有显著统计学差异，而心房与心室组织AT4受体含量比较，无明显差异。使用氯沙坦后，各组织对照组与氯沙坦组比较，均无明显统计学差异。详见图2。
讨论
1、不同亚型AngII受体mRNA的在不同器官的表达
AngII受体广泛分布于心血管、肾脏、大脑组织中，不同亚型的AngII受体在不同器官分布不同。其中AT1受体在肾脏的表达量最多【5、6】，而在心脏，主要位于窦房结、房室结及传导系统，在心房中含量高于心室，【7】。而AT2受体主要分布于胚胎组织中，出生后明显下降，在成年组织中几乎检测不到。AT4受体主要以肾脏、心脏、血管、大脑最为丰富，尚未有试验比较AT4受体在不同器官分布的差异。本实验发现，AT1受体在肾脏组织中表达最多，其次是心房，而动脉及心室组织表达较弱，与上述结果一致。但是本试验在所选4个组织器官中均未检测到AT2mRNA的表达，考虑与本试验所用家兔为成年兔有关，与有关报道一致【6】。本试验发现AT4受体在肾脏表达最多，其次是胸主动脉，综上分析，AT1、AT4受体均主要分布于肾脏组织，提示肾脏是RAS系统作用的主要效应器官。
2、氯沙坦对不同亚型的AngII受体表达的影响
ARB作用机制主要通过特异性抑制AT1受体与AngII的结合，发挥降压、扩张血管、抗增殖等作用，目前研究表明，ARB类药物可影响AngII受体基因的表达。而ARB对AT1受体mRNA表达的结果并不一致。早期的试验认为，ARB反馈性升高循环中AngII的水平，AT1受体长期暴露于高浓度的AngII，可诱导AT1受体mRNA表达升高。如Xu Y等在狗心梗模型中发现，氯沙坦可上调AT1、AT2受体的表达发挥保护心脏作用。而近期的试验则表明，ARB可下调众多组织AT1受体的表达。如Nio Y 等【4】发现ARB可有效抑制心肌梗死诱发的AT1受体的表达。Asano等发现氯沙坦降低心衰病人心脏AT1受体的密度。Diep QN等则发现氯沙坦可以下调高血压大鼠胸主动脉AT1受体的表达。最新的研究也表明，外源性给予AngII，可上调下丘脑AT1受体的表达，而氯沙坦则可以抑制这种作用。上述结果的不一致，可能与不同的试验模型、检测组织不同有关。而本试验以正常家兔为检测模型，发现氯沙坦可以明显下调肾脏、心房组织AT1受体的表达，分析其原因，AT1受体的下调，可能与ARB抑制AT1受体与AngII结合、引起通过AT1受体信号传导减少、AT1受体内化、合成减少有关，或者是反馈性升高的AngII引起AT1受体mRNA的稳定性下降。同时，本试验还发现，氯沙坦对肾脏、心房组织的AT1受体的下调作用要明显大于对心房、心室、动脉组织的AT1受体表达影响，分析原因可能与AT1受体在这两种组织中分布密度高有关，提示肾脏及心房可能为ARB作用的主要靶器官。AT1受体下调，可使ARB引起的循环及局部组织反馈性增高的AngII的反应降低。但是，AT1受体的下调，也意味着有效的AngII水平升高，那么增加的AngII会产生什么样的临床效应？近年众多研究表明，升高的AngII与AT2受体的结合增加，可能引起AT2受体表达上调。由于本实验没有检测到AT2受体的表达，故未观察到氯沙坦对AT2受体表达的影响，关于这部分的研究，有待进一步深入。 目前关于影响AT4受体表达的因素较少。Moeller I研究表明，球囊损伤可以增加兔颈动脉内膜AT4受体的表达，这种作用可能由内膜的损伤引起RAS系统激活、AngIV生成增加诱发AT4受体表达上调引起。最新的研究表明，给予ARB类药物坎地沙坦可以降低急性脑缺血大鼠的死亡率及梗死面积，但是同时给予AT2、AT4受体拮抗剂，坎地沙坦对急性脑缺血的保护作用消失，提示坎地沙坦对脑缺血的保护作用由AT2、AT4受体介导。本试验首次观察氯沙坦对AT4受体表达的影响，结果未发现氯沙坦对AT4受体的表达产生明显影响，ARB类药物与AT4受体之间的关系有待进一步研究。
3、本试验的不足之处
1）本试验所用氯沙坦药物为缓释片剂，磨碎后溶解使用可能影响氯沙坦本身的药代动力学。
2）由于目前未检测家兔AT4受体的核酸序列，本试验AT4受体的引物选用人的核酸序列设计，同源性方面存在不足。
结论
1、 AT1、AT4受体mRNA在肾脏组织表达量最多，提示肾脏可能是RAS系统作用的主要效应器官。
2、 氯沙坦明显下调肾脏、心房组织AT1受体mRNA的表达，提示肾脏、心房组织可能为ARB作用的主要靶器官，氯沙坦对AT4受体mRNA的表达无明显影响。
参考文献：
[1] Okunish i H，Miyazaki M，Toda N. Evidence for a putatively new angiotensin II generating enzyme in the vascular wall .J Hypertens 1984，Jun，2（3）：277-84
[2] Okunishi H， Miyazaki M， Okamura T， Toda N. Different distribution of two types of angiotensin II generating enzymes in the ao rtic wall. Biochem Biophys Res Commun， 1987，149（3）： 1186-92
[3] Donoghue M， Hsieh F， Baronas E， Godbout K， Gosselin M， Stagliano N， Donovan M， Woolf B， Robison K， Jeyaseelan R， Breitbart RE， Acton S. A novel angiotensin converting enzyme related carboxypeptidase （ACE2） converts angiotensin I to angiotensin 1～9 . Circ Res ，2000 ，87（5）： E1-E9
[4] Nio Y， Matsubara H， Murasawa S， Kanasaki M， Inada M.Regulation of gene transcription of angiotensin II receptor subtypes in myocardial infarction.J Clin Invest ，1995，95（1）：46–54
[5] Edwards RM， Aiyar N： Angiotensin II receptor subtypes in the kidney.J Am Soc Nephrol ，1993，3（10）：1643–1652
[6] Shanmugam S， Llorens-Cortes C， Clauser E， Corvol P， Gasc JM. Expression of angiotensin AT2 receptor mRNA during development of the rat kidney and adrenal gland . Am J Physiol， 1995， 268（5 pt 2）： F922-F930.
[7] Rogg H， Schmid A， de Gasparo M.Identification and characterization of angiotensin II receptor subtypes in rabbit ventricular myocardium. Biochem Biophys Res Commun ，1990 Nov 30，173（1）：416–422
关键词 ：氯沙坦；AT1受体；AT2受体；AT4受体
AngII是RAS系统中最为重要的血管活性肽，AngII主要通过与特异的细胞膜受体发挥作用，目前已知的AngII受体有四种亚型，分别是血管紧张素1型（Angiotensin type1 AT1）、血管紧张素2型（Angiotensin type2 AT2）、血管紧张素3型（Angiotensin type1 AT3）、血管紧张素4型（Angiotensin type4 AT4）受体，近年，众多研究[1-4]发现长期服用ARB类药物后，可升高循环中AngII水平，但对不同组织AngII受体表达的影响研究较少，尤其ARB类药物对AT4受体表达的影响目前尚无报道。
本试验观察ARB类药物氯沙坦对正常家兔循环中、以及4个重要器官（心房、心室、胸主动脉、肾脏）不同亚型AngII受体（AT1、AT2、AT4）表达水平的影响，旨在探讨氯沙对循环及不同靶器官的生物学效应。
新西兰大耳白家兔18只，雌=8只，雄=10只，5-6月龄，体重2.5～3.5Kg，随机分为氯沙坦组、盐水对照。氯沙坦组以氯沙坦15mg. kg-1.d-1，研成粉末溶于10ml生理盐水，灌胃法饲养四周，对照组等量生理盐水10ml灌胃法饲养四周，每周给家兔称重，调整氯沙坦用量。
3、标本的采集和处理
3%戊巴比妥钠（30mg/Kg）耳缘静脉麻醉后，迅速开胸取腔静脉血、置入抗凝剂中上下颠倒混匀，待测AngII、ALD。取心脏、胸主动脉、肾脏，分离心房及心室，分别用冰生理盐水洗净，取>200mg组织称重，液氮保存待测组织。
5、统计学处理
各项观察指标均以均数±标准差表示，不同组织间比较用方差分析，各组织对照组与氯沙坦组比较用t检验，统计学软件SPSS11.5进行统计学处理，P<0.05为有统计学差异。
结果
1、氯沙坦对AT1受体mRNA表达的影响
正常家兔的AT1受体mRNA在不同组织的表达量不同。肾脏组织AT1受体mRNA 表达量最多，与心房、心室、动脉组织比较，P均<0.001，有显著统计学差异；其次是心房组织AT1受体mRNA表达量较多，与心室、动脉组织比较，P<0.001，有显著统计学差异。而心室与动脉组织AT1受体表达量偏低，两者比较无明显统计学差异。使用氯沙坦后，肾脏组织、心房组织AT1受体mRNA表达量均明显下调，两种组织对照组与氯沙坦组比较，P<0.001，均有显著统计学差异。而动脉组织AT1受体表达也有下调，但与对照组比较，P>0.05，无统计学差异；心室组织，氯沙坦组AT1受体mRNAl略有升高，但与对照组比较，P=0.094（P>0.05），无明显统计学差异。
2、氯沙坦对不同组织AT2受体mRNA表达
3、氯沙坦对不同组织AT4受体mRNA表达
本试验观察到，正常家兔AT4受体mRNA在肾脏表达量最高，与心房、心室、动脉组织比较，P<0.001，有显著统计学差异；其次是动脉组织含量较多，与心房、心室组织比较，P<0.001，有显著统计学差异，而心房与心室组织AT4受体含量比较，无明显差异。使用氯沙坦后，各组织对照组与氯沙坦组比较，均无明显统计学差异。详见图2。
讨论
1、不同亚型AngII受体mRNA的在不同器官的表达
AngII受体广泛分布于心血管、肾脏、大脑组织中，不同亚型的AngII受体在不同器官分布不同。其中AT1受体在肾脏的表达量最多【5、6】，而在心脏，主要位于窦房结、房室结及传导系统，在心房中含量高于心室，【7】。而AT2受体主要分布于胚胎组织中，出生后明显下降，在成年组织中几乎检测不到。AT4受体主要以肾脏、心脏、血管、大脑最为丰富，尚未有试验比较AT4受体在不同器官分布的差异。本实验发现，AT1受体在肾脏组织中表达最多，其次是心房，而动脉及心室组织表达较弱，与上述结果一致。但是本试验在所选4个组织器官中均未检测到AT2mRNA的表达，考虑与本试验所用家兔为成年兔有关，与有关报道一致【6】。本试验发现AT4受体在肾脏表达最多，其次是胸主动脉，综上分析，AT1、AT4受体均主要分布于肾脏组织，提示肾脏是RAS系统作用的主要效应器官。
2、氯沙坦对不同亚型的AngII受体表达的影响
ARB作用机制主要通过特异性抑制AT1受体与AngII的结合，发挥降压、扩张血管、抗增殖等作用，目前研究表明，ARB类药物可影响AngII受体基因的表达。而ARB对AT1受体mRNA表达的结果并不一致。早期的试验认为，ARB反馈性升高循环中AngII的水平，AT1受体长期暴露于高浓度的AngII，可诱导AT1受体mRNA表达升高。如Xu Y等在狗心梗模型中发现，氯沙坦可上调AT1、AT2受体的表达发挥保护心脏作用。而近期的试验则表明，ARB可下调众多组织AT1受体的表达。如Nio Y 等【4】发现ARB可有效抑制心肌梗死诱发的AT1受体的表达。Asano等发现氯沙坦降低心衰病人心脏AT1受体的密度。Diep QN等则发现氯沙坦可以下调高血压大鼠胸主动脉AT1受体的表达。最新的研究也表明，外源性给予AngII，可上调下丘脑AT1受体的表达，而氯沙坦则可以抑制这种作用。上述结果的不一致，可能与不同的试验模型、检测组织不同有关。而本试验以正常家兔为检测模型，发现氯沙坦可以明显下调肾脏、心房组织AT1受体的表达，分析其原因，AT1受体的下调，可能与ARB抑制AT1受体与AngII结合、引起通过AT1受体信号传导减少、AT1受体内化、合成减少有关，或者是反馈性升高的AngII引起AT1受体mRNA的稳定性下降。同时，本试验还发现，氯沙坦对肾脏、心房组织的AT1受体的下调作用要明显大于对心房、心室、动脉组织的AT1受体表达影响，分析原因可能与AT1受体在这两种组织中分布密度高有关，提示肾脏及心房可能为ARB作用的主要靶器官。AT1受体下调，可使ARB引起的循环及局部组织反馈性增高的AngII的反应降低。但是，AT1受体的下调，也意味着有效的AngII水平升高，那么增加的AngII会产生什么样的临床效应？近年众多研究表明，升高的AngII与AT2受体的结合增加，可能引起AT2受体表达上调。由于本实验没有检测到AT2受体的表达，故未观察到氯沙坦对AT2受体表达的影响，关于这部分的研究，有待进一步深入。 目前关于影响AT4受体表达的因素较少。Moeller I研究表明，球囊损伤可以增加兔颈动脉内膜AT4受体的表达，这种作用可能由内膜的损伤引起RAS系统激活、AngIV生成增加诱发AT4受体表达上调引起。最新的研究表明，给予ARB类药物坎地沙坦可以降低急性脑缺血大鼠的死亡率及梗死面积，但是同时给予AT2、AT4受体拮抗剂，坎地沙坦对急性脑缺血的保护作用消失，提示坎地沙坦对脑缺血的保护作用由AT2、AT4受体介导。本试验首次观察氯沙坦对AT4受体表达的影响，结果未发现氯沙坦对AT4受体的表达产生明显影响，ARB类药物与AT4受体之间的关系有待进一步研究。
3、本试验的不足之处
1）本试验所用氯沙坦药物为缓释片剂，磨碎后溶解使用可能影响氯沙坦本身的药代动力学。
2）由于目前未检测家兔AT4受体的核酸序列，本试验AT4受体的引物选用人的核酸序列设计，同源性方面存在不足。
结论
1、 AT1、AT4受体mRNA在肾脏组织表达量最多，提示肾脏可能是RAS系统作用的主要效应器官。
2、 氯沙坦明显下调肾脏、心房组织AT1受体mRNA的表达，提示肾脏、心房组织可能为ARB作用的主要靶器官，氯沙坦对AT4受体mRNA的表达无明显影响。
参考文献：
[1] Okunish i H，Miyazaki M，Toda N. Evidence for a putatively new angiotensin II generating enzyme in the vascular wall .J Hypertens 1984，Jun，2（3）：277-84
[2] Okunishi H， Miyazaki M， Okamura T， Toda N. Different distribution of two types of angiotensin II generating enzymes in the ao rtic wall. Biochem Biophys Res Commun， 1987，149（3）： 1186-92
[3] Donoghue M， Hsieh F， Baronas E， Godbout K， Gosselin M， Stagliano N， Donovan M， Woolf B， Robison K， Jeyaseelan R， Breitbart RE， Acton S. A novel angiotensin converting enzyme related carboxypeptidase （ACE2） converts angiotensin I to angiotensin 1～9 . Circ Res ，2000 ，87（5）： E1-E9
[4] Nio Y， Matsubara H， Murasawa S， Kanasaki M， Inada M.Regulation of gene transcription of angiotensin II receptor subtypes in myocardial infarction.J Clin Invest ，1995，95（1）：46–54
[5] Edwards RM， Aiyar N： Angiotensin II receptor subtypes in the kidney.J Am Soc Nephrol ，1993，3（10）：1643–1652
[6] Shanmugam S， Llorens-Cortes C， Clauser E， Corvol P， Gasc JM. Expression of angiotensin AT2 receptor mRNA during development of the rat kidney and adrenal gland . Am J Physiol， 1995， 268（5 pt 2）： F922-F930.
[7] Rogg H， Schmid A， de Gasparo M.Identification and characterization of angiotensin II receptor subtypes in rabbit ventricular myocardium. Biochem Biophys Res Commun ，1990 Nov 30，173（1）：416–422