miR-21是在哺乳动物体内最早检测到的miRNAs之一,miR-21-5p作为miR-21家族成员,研究发现其在上皮性卵巢癌、乳腺癌、胸腺上皮肿瘤、胃癌中均高表达且发挥抑制细胞凋亡的作用,目前对miR-21-5p的研究多局限于肿瘤方面,对乳腺发育以及泌乳方面鲜有报道。本课题组前期通过高通量测序研究发现miR-21-5p在奶山羊泌乳前期和泌乳高峰期的乳腺组织中差异表达,表明miR-21-5p可能在调控乳腺发育中有重要作用。有研究表明miRNA通过调控靶基因的表达对乳腺上皮细胞的生长发育和泌乳功能进行调节,本试验通过生物信息学网站预测PDCD4可能为miR-21-5p靶基因,并且推测miR-21-5p可能通过PDCD4调控奶山羊乳腺上皮细胞凋亡及泌乳。为此,本研究以奶山羊乳腺上皮细胞(GMECs)为研究对象,利用RT-PCR、Westernblot、CCK-8、EDU、流式细胞术、ELISA等技术,通过构建过表达载体及合成干扰RNA的方法,研究miR-21-5p对PDCD4的调控作用以及miR-21-5p和PDCD4对奶山羊乳腺上皮细胞增殖、凋亡和泌乳的影响,研究结果如下:1.miR-21-5p对奶山羊乳腺上皮细胞增殖、凋亡和泌乳功能的调控作用EdU、CCK-8结果显示,miR-21-5p促进GMECs的增殖(P<0.05);流式细胞法检测细胞凋亡结果显示,miR-21-5p抑制GMECs的凋亡(P<0.01)。ELISA结果显示,miR-21-5p促进GMECs分泌甘油三酯和β-酪蛋白(P<0.01)。通过Westernblot检测PI3K/mTOR和ERK信号通路上相关蛋白的表达量,结果表明,miR-21-5p能显著上调PI3K、mTOR、S6K的磷酸化水平(P<0.01),激活PI3K/mTOR信号通路,同时,显著上调ERK的磷酸化水平以及Bcl-2的表达量(P<0.01),下调Bax的表达量(P<0.01),激活ERK通路。以上结果表明miR-21-5p可以通过ERK通路抑制GMECs凋亡,通过PI3K/mTOR信号通路促进GMECs分泌甘油三酯和β-酪蛋白。2.奶山羊乳腺上皮细胞中miR-21-5p对PDCD4基因的调控作用生物信息学预测软件发现,PDCD4的3′UTR区含有miR-21-5p的靶向结合位点。双荧光素酶活性检测结果显示,miR-21-5p可以降低野生型载体的荧光素酶活性(P<0.05),而对突变型载体无显著影响。RT-qPCR和Westernblot结果显示,miR-21-5p可以显著降低PDCD4的mRNA和蛋白表达量(P<0.01)。以上研究表明PDCD4是miR-21-5p的靶基因,且miR-21-5p负调控PDCD4的表达。3.过表达及干扰PDCD4对奶山羊乳腺上皮细胞增殖、凋亡和泌乳功能的调控作用EdU、CCK-8结果显示,过表达PDCD4能抑制细胞增殖(P<0.01),干扰PDCD4能促进GMECs的增殖(P<0.01);流式细胞法检测细胞凋亡结果显示,过表达PDCD4能促进细胞凋亡(P<0.01),干扰PDCD4能抑制GMECs的凋亡(P<0.01)。ELISA结果显示,干扰PDCD4能促进GMECs分泌甘油三酯和β-酪蛋白(P<0.01)。通过Westernblot检测PI3K/mTOR和ERK信号通路上相关蛋白的表达量,结果表明,干扰PDCD4能显著上调PI3K、mTOR、S6K的磷酸化水平(P<0.01),激活PI3K/mTOR信号通路,进而促进GMECs分泌β-酪蛋白和甘油三酯;同时,显著上调ERK的磷酸化水平以及Bcl-2的表达量(P<0.01),下调Bax的表达量(P<0.01),激活ERK通路,进而促进GMECs增殖,抑制其凋亡。以上结果表明PDCD4可以通过ERK和PI3K/mTOR信号通路调控奶山羊乳腺上皮细胞增殖、凋亡及甘油三酯和β-酪蛋白的分泌。综上所述,miR-21-5p能够通过负调控PDCD4激活ERK和PI3K/mTOR信号通路进而调控GMECs增殖、凋亡及甘油三酯和β-酪蛋白的分泌。