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目的：
观察调理脾胃针法对脾虚湿盛型2型糖尿病肾病患者的作用及其机制，以进一步阐明该针法治疗此类病证的相关机理。
方法：
选择2017年10月至2018年5月在天津市中医药研究院附属医院针灸科病房确诊为脾虚湿盛型2型糖尿病肾病的患者，所有研究对象均知情同意后入选本试验。按照随机数字表法将符合纳入标准的患者随机分为观察组与对照组。两组患者均施以对症基础治疗，观察组采用调理脾胃针法加取白环俞双、肾俞双、膏肓双、中极；对照组取胰俞、肺俞双、脾俞双、肾俞双、三阴交双、太溪双、复溜双、太冲双、关元、命门。针刺得气后施以相应补泻，每次留针30min，每日2次，6天为一疗程，休息1天后，继续第二个疗程，共计4个疗程。分别于试验开始前及4疗程结束后检测患者的24h尿蛋白定量、血糖、糖化血红蛋白、外周血细胞计数、中性粒细胞/淋巴细胞比、外周血T淋巴细胞亚群及8-羟基脱氧鸟苷、蛋白质羰基含量，并采用单细胞凝胶电泳技术观察淋巴细胞DNA损伤情况。同时按随机数字表法抽取观察组治疗前后淋巴细胞绝对值升高的患者5例，分别标记为Pre-DN组(调理脾胃针法干预前)、Post-DN组(调理脾胃针法干预后)，同时招募正常健康成人5例，标记为NormalGroup组，采用MethylationEPICBeadChip甲基化芯片进行DNA甲基化筛查，并对筛选的特定基因进行启动子区域CpG岛甲基化及mRNA表达验证。采用统计学软件SPSS19.0进行统计分析，R软件处理甲基化芯片数据。
结果：
一、调理脾胃针法对脾虚湿盛型糖尿病肾病患者的临床作用
1.本研究共纳入111例患者，最终完成102例，其中观察组和对照组各51例。治疗前的两组人口学特征及临床基线资料差异无统计学意义，具有可比性。
2.主要疗效指标：两组患者治疗前的24h尿蛋白定量方差相齐(P＞0.05)，经独立样本t检验分析，P＞0.05，表明两组患者治疗前的24h尿蛋白定量比较无统计学差异，具有可比性。治疗后的24h尿蛋白定量方差不齐(P＜0.05)；经独立样本t′检验分析，P＜0.05，表明两组患者治疗后的24h尿蛋白定量比较差异具有显著性统计学意义。两组组内治疗前后的24h尿蛋白定量比较，两组P均＜0.05，表明差异均具有统计学意义。
3.次要疗效指标：
(1)两组患者血糖、糖化血红蛋白(HbA1c)比较
两组患者治疗前的FBG、2hPBG、HbA1c方差相齐，经独立样本t检验分析，治疗前FBG、2hPBG、HbA1c的P值均＞0.05，表明治疗前两组患者间的FBG、2hPBG、HbA1c无统计学差异，具有可比性。两组患者治疗后的2hPBG方差相齐，而FBG、HbA1c方差不齐，经独立样本t检验分析，治疗后的2hPBG(P＜0.05)；经Mann-WhitneyU检验，治疗后两组患者的FBG、HbA1c(P＞0.05)，表明治疗后两组患者的2hPBG差异具有统计学意义，而FBG、HbA1c无统计学差异。
组内治疗前后经配对样本t检验，观察组FBG(P＞0.05)，2hPBG、HbA1c(P＜0.05)；对照组的FBG、HbA1c(P＞0.05)，2hPBG(P＜0.05)，表明两组治疗前后的FBG及对照组治疗后的HbA1c无统计学差异，而两组治疗前后的2hPBG及观察组治疗后的HbA1c差异具有统计学意义。
(2)两组患者外周血细胞指数及NLR比较
两组患者治疗前的中性粒细胞绝对值、淋巴细胞绝对值、单核细胞绝对值方差相齐，而白细胞、血小板计数方差不齐，经独立样本t检验分析，治疗前的中性粒细胞绝对值、淋巴细胞绝对值、单核细胞绝对值(P均＞0.05)；经独立样本t′检验分析，治疗前的白细胞(P＞0.05)、血小板计数(P＜0.05)，表明两组患者治疗前的外周血白细胞计数、白细胞分类计数无统计学差异，具有可比性。两组治疗后的淋巴细胞绝对值、单核细胞绝对值、白细胞、血小板计数方差相齐，而中性粒细胞绝对值方差不齐；经独立样本t检验分析，治疗后的淋巴细胞绝对值、单核细胞绝对值、白细胞(P均＜0.05)，血小板计数(P＞0.05)；经独立样本t检验分析，治疗后的中性粒细胞绝对值(P＜0.05)，表明两组治疗后的白细胞、中性粒细胞绝对值、淋巴细胞绝对值、单核细胞绝对值的差异具有统计学意义。
经Mann-WhitneyU检验，两组患者治疗前的NLR(P＞0.05)，治疗后的NLR(P＜0.05)。表明两组治疗前的NLR差异无统计学意义，具有可比性；治疗后的NLR两组间具有统计学差异。
组内治疗前后经配对样本t检验，观察组治疗前后白细胞、中性粒细胞绝对值、淋巴细胞绝对值、单核细胞绝对值(P均＜0.05)，血小板计数(P＞0.05)；对照组治疗前后白细胞、中性粒细胞绝对值、淋巴细胞绝对值、单核细胞绝对值、血小板计数(P均＞0.05)，表明观察组治疗前后的白细胞、中性粒细胞绝对值、淋巴细胞绝对值、单核细胞绝对值及对照组治疗前后的中性粒细胞绝对值的差异具有统计学意义。组内治疗前后采用Wilcoxon符号秩和检验，观察组NLR和对照组NLR的P均＜0.05，结果表明两组治疗前后的NLR差异具有统计学意义。
4.两组治疗后的安全性评价分析均显示两种治疗方法安全可行。
二、调理脾胃针法对脾虚湿盛型2型糖尿病肾病患者T淋巴细胞的作用
1.两组患者治疗前后T淋巴细胞亚群比较
两组患者治疗前的CD3+、CD8+、CD4+/CD8+方差不齐(P均＜0.05)，而CD4+方差相齐(P＞0.05)；经独立样本t检验分析，治疗前的CD4+(P＞0.05)，经独立样本t′检验分析，治疗前的CD3+、CD8+、CD4+/CD8+的P均＞0.05，表明两组患者治疗前的T淋巴细胞亚群无统计学差异，具有可比性。两组患者治疗后的CD3+、CD4+、CD8+、CD4+/CD8+方差相齐(P均＞0.05)，经独立样本t检验分析，治疗后的CD3+、CD4+/CD8+(P＜0.05)，CD4+、CD8+(P＞0.05)，表明两组间治疗后的CD3+、CD4+/CD8+的差异具有统计学意义。
组内治疗前后经配对样本t检验，观察组CD3+、CD4+、CD8+、CD4+/CD8+的P值均＜0.05，表明观察组治疗前后CD3+、CD4+、CD8+、CD4+/CD8+的差异具有统计学意义；对照组治疗前后CD3+、CD8+(P＞0.05)，CD4+、CD4+/CD8+(P＜0.05)，表明对照组治疗前后的CD4+、CD4+/CD8+差异具有统计学意义。
2.两组患者治疗前后8-OHdG、PCO含量比较
两组患者治疗前的PCO方差相齐(P＞0.05)，8-OHdG的方差不齐(P＜0.05)；经独立样本t检验分析，治疗前PCO(P＞0.05)，经独立样本t′检验分析，治疗前8-OHdG(P＜0.05)，表明两组治疗前的8-OHdG存在统计学差异。两组患者治疗后8-OHdG、PCO的方差相齐(P＞0.05)，经独立样本t检验分析，治疗后8-OHdG(P＜0.05)、PCO(P＞0.05)，表明两组治疗后的PCO差异无统计学意义。
组内治疗前后经配对样本t检验，观察组8-OHdG、PCO的P值均＜0.05，对照组8-OHdG、PCO的P值也均＜0.05，表明两组组内比较，8-OHdG、PCO治疗前后的差异均具有统计学意义。
3.两组治疗前后单细胞凝胶电泳结果
(1)两组患者治疗前的Taillength、Tailmoment、Olivetailmoment方差相齐(P＞0.05)，而治疗前的HeadDNA、TailDNA方差不齐(P＜0.05)，经独立样本t检验分析，治疗前的Taillength(P＞0.05)，Tailmoment、Olivetailmoment(P＜0.05)；独立样本t′检验分析，治疗前HeadDNA、TailDNA(P＞0.05)，表明治疗前两组间的HeadDNA、TailDNA、Taillength无统计学差异，具有可比性，而Tailmoment、Olivetailmoment存在统计学差异。两组治疗后的HeadDNA、Taillength方差相齐(P＞0.05)，而TailDNA、Tailmoment、Olivetailmoment方差不齐(P＜0.05)，经独立样本t检验分析，治疗后的HeadDNA、Taillength(P＜0.05)；独立样本t′检验分析，治疗后TailDNA、Tailmoment、Olivetailmoment(P＜0.05)，表明治疗后的各项值差异具有统计学意义。
组内治疗前后经配对样本t检验，观察组HeadDNA、TailDNA、Taillength、Tailmoment、Olivetailmoment的P值均＜0.05，对照组TailDNA、Taillength、Tailmoment、Olivetailmoment的P值＜0.05，而HeadDNA的P值＞0.05，表明观察组治疗前后的各项差值均具有显著性差异，而对照组治疗前后HeadDNA的差异无统计学意义。
(2)单细胞凝胶电泳实验结果显示：脾虚湿盛型2型糖尿病肾病患者彗星样淋巴细胞增多，且彗星尾长及尾矩增长；针刺治疗后，两种方法均能减少彗星样细胞数，并使彗星尾长及尾矩缩短；同时与对照组相比，观察组(调理脾胃针法)干预后对淋巴细胞DNA损伤的修复作用改善更加明显。
三、脾虚湿盛型2型糖尿病肾病患者DNA甲基化及调理脾胃针法对其机制
1.各实验组样本DNA抽提并经NanoDrop分光光度计定量及琼脂糖凝胶电泳质检全部合格。本实验探针总数共745342个，以detectionp-values评估样本中的每个CpG位点的质量，结果表明本实验的探针质控符合数据分析要求。
2.差异甲基化位点分析：脾虚湿盛型2型糖尿病肾病患者存在1013个差异甲基化位点，其中高甲基化位点数554个、低甲基化位点459个，且这些差异甲基化位点在染色体上均有分布，未表现出明显的染色体偏向性分布特点。调理脾胃针法干预后出现了5个低差异甲基化位点基因，分别是cg11792281(NLK)、cg11869514(EFNA3)、cg14484845(SOGA1)、cg24037831(SYT9)、cg27640988(RNF103)，并且这5个低差异甲基化位点基因分别位于chr17(NLK)、chr1(EFNA3)、chr20(SOGA1)、chr11(SYT9)、chr2(RNF103)。
3.差异甲基化区域分析：全基因组甲基化水平结果显示各实验样本在转录起始位点存在低甲基化表达。进一步按基因注释分类和CpG岛注释分类，结果显示差异甲基化区域基因数最多的是CpGIsland，其次是TSS1500。虽然调理脾胃针法干预后与干预前差异甲基化区域的基因数目无显著差异，但结果显示调理脾胃针法干预后的差异甲基化区域基因数存在低差异甲基化区域基因数减少而高差异甲基化区域基因数增多的情况。
结合染色体及其甲基化区域位置信息，使用bumphunter算法寻找真正的差异甲基化区域。结果显示：脾虚湿盛型2型糖尿病肾病患者与正常人组比较的差异甲基化区域主要是位于chr6的32064555-32064633位置，在该区域内差异甲基化CpG岛的总数为483个。经调理脾胃针法干预后与干预前比较，差异甲基化区域则位于chr14的99684839位置附近。
基因启动子区域的研究结果显示：调理脾胃针法干预后、干预前分别与正常人比较，在启动子区域高甲基化基因数目分别是33、25个，低甲基化基因数目是各15个。经对比显示：调理脾胃针法干预后较之于干预前与正常人比较，启动子区域的差异高甲基化基因出现表达降低趋势的有10个，分别是HAR1A、TVP23B、PCDHB4、ADH4、LOC650226、TBX22、GRM2、RFPC2、HEATR4、SIAH2，而低差异甲基化基因呈升高趋势的有6个，分别是ZNF14、CHMP4C、C14orf126、PDIRN4、SPATA20、CERK。
4.差异位点基因的GO富集分析：调理脾胃针法干预前的脾虚湿盛型2型糖尿病肾病患者与正常人存在284个差异甲基化基因，涉及1082个GOterm。主要富集在GOterm生物过程中的多巴胺转运及分子功能中的3,5-环核苷酸磷酸二酯酶活性和环核苷酸磷酸二酯酶活性；参与刺激应答、细胞信号传导及代谢等生物过程的差异甲基化基因数较多；这些基因涉及细胞质、细胞外周、质膜、内膜系统、骨架等细胞组成；影响核苷结合的差异甲基化基因数最多。
经调理脾胃针法干预后与干预前比较，映射的3个GOterm中均有4个基因(即SOGA1、RNF103、EFNA3、NLK)存在低甲基化，主要涉及生物过程中的细胞对刺激的反应。3个GOterm分别是细胞对刺激的反应(cellularresponsetostimulus)、刺激应答(responsetostimulus)、细胞过程(cellularprocess)。
5.差异位点基因的KEGG富集分析：脾虚湿盛型2型糖尿病肾病患者与正常人比较存在178个差异甲基化基因参与了209条KEGGpathway，差异甲基化基因在不饱和脂肪酸的生物合成(Biosynthesisofunsaturatedfattyacids)中富集显著，涉及的KEGGpathway主要包括细胞过程(cellularprocesses)、环境信息处理(environmentalinformationprocessing)、遗传信息处理(geneticinformationprocessing)、人类疾病(humandiseases)、代谢(metabolism)、生物系统(organismalsystems)等。差异甲基化基因参与数目较多的KEGGpathway信号转导途径主要代谢途径(Metabolicpathways)、癌症途径(Pathwaysincancer)、PI3K-Akt信号通路(PI3K-Aktsignalingpathway)等。
调理脾胃针法干预后的脾虚湿盛型2型糖尿病肾病患者与干预前比较，存在1个低差异甲基化基因(NLK)分别参与了4条KEGGpathway，分别是黏着连接(Adherensjunction)、MAPK信号通路(MAPKsignalingpathway)、Wnt信号通路(Wntsignalingpathway)及FoxO信号通路(FoxOsignalingpathway)。
6.特定基因NLK在不同基因区段的甲基化变化水平存在差异。
四、调理脾胃针法对脾虚湿盛型2型糖尿病肾病患者基因NLK甲基化及mRNA表达验证
1.各实验组样本RNA抽提后，经NanoDrop分光光度计定量及Agilent2100生物分析仪电泳检测质检全部合格。各实验组样本DNA抽提后，经NanoDrop分光光度计定量及琼脂糖凝胶电泳质检全部合格。
2.实时定量PCR结果显示：调理脾胃针法干预前后及正常人组均能检测到NLKmRNA的表达和扩增，且扩增、溶解过程检测稳定。但脾虚湿盛型2型糖尿病肾病与正常人组NLKmRNA的表达水平比较，P＞0.05，表明无统计学意义；经调理脾胃针法干预后，NLK在的脾虚湿盛型2型糖尿病肾病患者中NLKmRNA与干预前比表达升高，但组间差异无统计学意义，P＞0.05。
3.焦磷酸测序验证结果显示：在各实验组样本中，基因NLK启动子区上存在的一个CpG位点均能检测到甲基化改变，脾虚湿盛型2型糖尿病肾病患者与正常人比较，NLK启动子区CpG岛发生了高甲基化改变，差异具有统计学意义，P＜0.05。经调理脾胃针法治疗后NLK启动子区CpG岛的甲基化程度降低，但降低程度与治疗前比较无统计学差异，P＞0.05。
4.基因NLK启动子区CpG岛甲基化水平与NLKmRNA表达水平的相关性分析结果显示：调理脾胃针法治疗前后的NLKmRNA表达水平与DNA甲基化水平之间未发现相关性。
结论：
1.调理脾胃针法能降低脾虚湿盛型2型糖尿病肾病患者的蛋白尿，对其2hPBG、糖化血红蛋白具有一定的改善作用；并能通过降低中性粒细胞数及NLR、升高淋巴细胞数，以增强患者的适应性免疫。
2.脾虚湿盛型2型糖尿病肾病患者存在T淋巴细胞亚群失衡及淋巴细胞DNA损伤。调理脾胃针法能调节T淋巴细胞亚群的平衡并修复淋巴细胞DNA氧化损伤，提高机体免疫功能，维持免疫稳态。
3.脾虚湿盛型2型糖尿病肾病患者的发病过程中存在DNA甲基化水平表达的异常，调理脾胃针法可能对基因NLK甲基化具有一定的调控作用。
4.脾虚湿盛型2型糖尿病肾病患者基因NLK的mRNA表达水平和启动子区CpG岛甲基化水平存在差异。调理脾胃针法对基因NLK启动子区CpG岛高甲基化的表达存在一定的改善趋势。
观察调理脾胃针法对脾虚湿盛型2型糖尿病肾病患者的作用及其机制，以进一步阐明该针法治疗此类病证的相关机理。
方法：
选择2017年10月至2018年5月在天津市中医药研究院附属医院针灸科病房确诊为脾虚湿盛型2型糖尿病肾病的患者，所有研究对象均知情同意后入选本试验。按照随机数字表法将符合纳入标准的患者随机分为观察组与对照组。两组患者均施以对症基础治疗，观察组采用调理脾胃针法加取白环俞双、肾俞双、膏肓双、中极；对照组取胰俞、肺俞双、脾俞双、肾俞双、三阴交双、太溪双、复溜双、太冲双、关元、命门。针刺得气后施以相应补泻，每次留针30min，每日2次，6天为一疗程，休息1天后，继续第二个疗程，共计4个疗程。分别于试验开始前及4疗程结束后检测患者的24h尿蛋白定量、血糖、糖化血红蛋白、外周血细胞计数、中性粒细胞/淋巴细胞比、外周血T淋巴细胞亚群及8-羟基脱氧鸟苷、蛋白质羰基含量，并采用单细胞凝胶电泳技术观察淋巴细胞DNA损伤情况。同时按随机数字表法抽取观察组治疗前后淋巴细胞绝对值升高的患者5例，分别标记为Pre-DN组(调理脾胃针法干预前)、Post-DN组(调理脾胃针法干预后)，同时招募正常健康成人5例，标记为NormalGroup组，采用MethylationEPICBeadChip甲基化芯片进行DNA甲基化筛查，并对筛选的特定基因进行启动子区域CpG岛甲基化及mRNA表达验证。采用统计学软件SPSS19.0进行统计分析，R软件处理甲基化芯片数据。
结果：
一、调理脾胃针法对脾虚湿盛型糖尿病肾病患者的临床作用
1.本研究共纳入111例患者，最终完成102例，其中观察组和对照组各51例。治疗前的两组人口学特征及临床基线资料差异无统计学意义，具有可比性。
2.主要疗效指标：两组患者治疗前的24h尿蛋白定量方差相齐(P＞0.05)，经独立样本t检验分析，P＞0.05，表明两组患者治疗前的24h尿蛋白定量比较无统计学差异，具有可比性。治疗后的24h尿蛋白定量方差不齐(P＜0.05)；经独立样本t′检验分析，P＜0.05，表明两组患者治疗后的24h尿蛋白定量比较差异具有显著性统计学意义。两组组内治疗前后的24h尿蛋白定量比较，两组P均＜0.05，表明差异均具有统计学意义。
3.次要疗效指标：
(1)两组患者血糖、糖化血红蛋白(HbA1c)比较
两组患者治疗前的FBG、2hPBG、HbA1c方差相齐，经独立样本t检验分析，治疗前FBG、2hPBG、HbA1c的P值均＞0.05，表明治疗前两组患者间的FBG、2hPBG、HbA1c无统计学差异，具有可比性。两组患者治疗后的2hPBG方差相齐，而FBG、HbA1c方差不齐，经独立样本t检验分析，治疗后的2hPBG(P＜0.05)；经Mann-WhitneyU检验，治疗后两组患者的FBG、HbA1c(P＞0.05)，表明治疗后两组患者的2hPBG差异具有统计学意义，而FBG、HbA1c无统计学差异。
组内治疗前后经配对样本t检验，观察组FBG(P＞0.05)，2hPBG、HbA1c(P＜0.05)；对照组的FBG、HbA1c(P＞0.05)，2hPBG(P＜0.05)，表明两组治疗前后的FBG及对照组治疗后的HbA1c无统计学差异，而两组治疗前后的2hPBG及观察组治疗后的HbA1c差异具有统计学意义。
(2)两组患者外周血细胞指数及NLR比较
两组患者治疗前的中性粒细胞绝对值、淋巴细胞绝对值、单核细胞绝对值方差相齐，而白细胞、血小板计数方差不齐，经独立样本t检验分析，治疗前的中性粒细胞绝对值、淋巴细胞绝对值、单核细胞绝对值(P均＞0.05)；经独立样本t′检验分析，治疗前的白细胞(P＞0.05)、血小板计数(P＜0.05)，表明两组患者治疗前的外周血白细胞计数、白细胞分类计数无统计学差异，具有可比性。两组治疗后的淋巴细胞绝对值、单核细胞绝对值、白细胞、血小板计数方差相齐，而中性粒细胞绝对值方差不齐；经独立样本t检验分析，治疗后的淋巴细胞绝对值、单核细胞绝对值、白细胞(P均＜0.05)，血小板计数(P＞0.05)；经独立样本t检验分析，治疗后的中性粒细胞绝对值(P＜0.05)，表明两组治疗后的白细胞、中性粒细胞绝对值、淋巴细胞绝对值、单核细胞绝对值的差异具有统计学意义。
经Mann-WhitneyU检验，两组患者治疗前的NLR(P＞0.05)，治疗后的NLR(P＜0.05)。表明两组治疗前的NLR差异无统计学意义，具有可比性；治疗后的NLR两组间具有统计学差异。
组内治疗前后经配对样本t检验，观察组治疗前后白细胞、中性粒细胞绝对值、淋巴细胞绝对值、单核细胞绝对值(P均＜0.05)，血小板计数(P＞0.05)；对照组治疗前后白细胞、中性粒细胞绝对值、淋巴细胞绝对值、单核细胞绝对值、血小板计数(P均＞0.05)，表明观察组治疗前后的白细胞、中性粒细胞绝对值、淋巴细胞绝对值、单核细胞绝对值及对照组治疗前后的中性粒细胞绝对值的差异具有统计学意义。组内治疗前后采用Wilcoxon符号秩和检验，观察组NLR和对照组NLR的P均＜0.05，结果表明两组治疗前后的NLR差异具有统计学意义。
4.两组治疗后的安全性评价分析均显示两种治疗方法安全可行。
二、调理脾胃针法对脾虚湿盛型2型糖尿病肾病患者T淋巴细胞的作用
1.两组患者治疗前后T淋巴细胞亚群比较
两组患者治疗前的CD3+、CD8+、CD4+/CD8+方差不齐(P均＜0.05)，而CD4+方差相齐(P＞0.05)；经独立样本t检验分析，治疗前的CD4+(P＞0.05)，经独立样本t′检验分析，治疗前的CD3+、CD8+、CD4+/CD8+的P均＞0.05，表明两组患者治疗前的T淋巴细胞亚群无统计学差异，具有可比性。两组患者治疗后的CD3+、CD4+、CD8+、CD4+/CD8+方差相齐(P均＞0.05)，经独立样本t检验分析，治疗后的CD3+、CD4+/CD8+(P＜0.05)，CD4+、CD8+(P＞0.05)，表明两组间治疗后的CD3+、CD4+/CD8+的差异具有统计学意义。
组内治疗前后经配对样本t检验，观察组CD3+、CD4+、CD8+、CD4+/CD8+的P值均＜0.05，表明观察组治疗前后CD3+、CD4+、CD8+、CD4+/CD8+的差异具有统计学意义；对照组治疗前后CD3+、CD8+(P＞0.05)，CD4+、CD4+/CD8+(P＜0.05)，表明对照组治疗前后的CD4+、CD4+/CD8+差异具有统计学意义。
2.两组患者治疗前后8-OHdG、PCO含量比较
两组患者治疗前的PCO方差相齐(P＞0.05)，8-OHdG的方差不齐(P＜0.05)；经独立样本t检验分析，治疗前PCO(P＞0.05)，经独立样本t′检验分析，治疗前8-OHdG(P＜0.05)，表明两组治疗前的8-OHdG存在统计学差异。两组患者治疗后8-OHdG、PCO的方差相齐(P＞0.05)，经独立样本t检验分析，治疗后8-OHdG(P＜0.05)、PCO(P＞0.05)，表明两组治疗后的PCO差异无统计学意义。
组内治疗前后经配对样本t检验，观察组8-OHdG、PCO的P值均＜0.05，对照组8-OHdG、PCO的P值也均＜0.05，表明两组组内比较，8-OHdG、PCO治疗前后的差异均具有统计学意义。
3.两组治疗前后单细胞凝胶电泳结果
(1)两组患者治疗前的Taillength、Tailmoment、Olivetailmoment方差相齐(P＞0.05)，而治疗前的HeadDNA、TailDNA方差不齐(P＜0.05)，经独立样本t检验分析，治疗前的Taillength(P＞0.05)，Tailmoment、Olivetailmoment(P＜0.05)；独立样本t′检验分析，治疗前HeadDNA、TailDNA(P＞0.05)，表明治疗前两组间的HeadDNA、TailDNA、Taillength无统计学差异，具有可比性，而Tailmoment、Olivetailmoment存在统计学差异。两组治疗后的HeadDNA、Taillength方差相齐(P＞0.05)，而TailDNA、Tailmoment、Olivetailmoment方差不齐(P＜0.05)，经独立样本t检验分析，治疗后的HeadDNA、Taillength(P＜0.05)；独立样本t′检验分析，治疗后TailDNA、Tailmoment、Olivetailmoment(P＜0.05)，表明治疗后的各项值差异具有统计学意义。
组内治疗前后经配对样本t检验，观察组HeadDNA、TailDNA、Taillength、Tailmoment、Olivetailmoment的P值均＜0.05，对照组TailDNA、Taillength、Tailmoment、Olivetailmoment的P值＜0.05，而HeadDNA的P值＞0.05，表明观察组治疗前后的各项差值均具有显著性差异，而对照组治疗前后HeadDNA的差异无统计学意义。
(2)单细胞凝胶电泳实验结果显示：脾虚湿盛型2型糖尿病肾病患者彗星样淋巴细胞增多，且彗星尾长及尾矩增长；针刺治疗后，两种方法均能减少彗星样细胞数，并使彗星尾长及尾矩缩短；同时与对照组相比，观察组(调理脾胃针法)干预后对淋巴细胞DNA损伤的修复作用改善更加明显。
三、脾虚湿盛型2型糖尿病肾病患者DNA甲基化及调理脾胃针法对其机制
1.各实验组样本DNA抽提并经NanoDrop分光光度计定量及琼脂糖凝胶电泳质检全部合格。本实验探针总数共745342个，以detectionp-values评估样本中的每个CpG位点的质量，结果表明本实验的探针质控符合数据分析要求。
2.差异甲基化位点分析：脾虚湿盛型2型糖尿病肾病患者存在1013个差异甲基化位点，其中高甲基化位点数554个、低甲基化位点459个，且这些差异甲基化位点在染色体上均有分布，未表现出明显的染色体偏向性分布特点。调理脾胃针法干预后出现了5个低差异甲基化位点基因，分别是cg11792281(NLK)、cg11869514(EFNA3)、cg14484845(SOGA1)、cg24037831(SYT9)、cg27640988(RNF103)，并且这5个低差异甲基化位点基因分别位于chr17(NLK)、chr1(EFNA3)、chr20(SOGA1)、chr11(SYT9)、chr2(RNF103)。
3.差异甲基化区域分析：全基因组甲基化水平结果显示各实验样本在转录起始位点存在低甲基化表达。进一步按基因注释分类和CpG岛注释分类，结果显示差异甲基化区域基因数最多的是CpGIsland，其次是TSS1500。虽然调理脾胃针法干预后与干预前差异甲基化区域的基因数目无显著差异，但结果显示调理脾胃针法干预后的差异甲基化区域基因数存在低差异甲基化区域基因数减少而高差异甲基化区域基因数增多的情况。
结合染色体及其甲基化区域位置信息，使用bumphunter算法寻找真正的差异甲基化区域。结果显示：脾虚湿盛型2型糖尿病肾病患者与正常人组比较的差异甲基化区域主要是位于chr6的32064555-32064633位置，在该区域内差异甲基化CpG岛的总数为483个。经调理脾胃针法干预后与干预前比较，差异甲基化区域则位于chr14的99684839位置附近。
基因启动子区域的研究结果显示：调理脾胃针法干预后、干预前分别与正常人比较，在启动子区域高甲基化基因数目分别是33、25个，低甲基化基因数目是各15个。经对比显示：调理脾胃针法干预后较之于干预前与正常人比较，启动子区域的差异高甲基化基因出现表达降低趋势的有10个，分别是HAR1A、TVP23B、PCDHB4、ADH4、LOC650226、TBX22、GRM2、RFPC2、HEATR4、SIAH2，而低差异甲基化基因呈升高趋势的有6个，分别是ZNF14、CHMP4C、C14orf126、PDIRN4、SPATA20、CERK。
4.差异位点基因的GO富集分析：调理脾胃针法干预前的脾虚湿盛型2型糖尿病肾病患者与正常人存在284个差异甲基化基因，涉及1082个GOterm。主要富集在GOterm生物过程中的多巴胺转运及分子功能中的3,5-环核苷酸磷酸二酯酶活性和环核苷酸磷酸二酯酶活性；参与刺激应答、细胞信号传导及代谢等生物过程的差异甲基化基因数较多；这些基因涉及细胞质、细胞外周、质膜、内膜系统、骨架等细胞组成；影响核苷结合的差异甲基化基因数最多。
经调理脾胃针法干预后与干预前比较，映射的3个GOterm中均有4个基因(即SOGA1、RNF103、EFNA3、NLK)存在低甲基化，主要涉及生物过程中的细胞对刺激的反应。3个GOterm分别是细胞对刺激的反应(cellularresponsetostimulus)、刺激应答(responsetostimulus)、细胞过程(cellularprocess)。
5.差异位点基因的KEGG富集分析：脾虚湿盛型2型糖尿病肾病患者与正常人比较存在178个差异甲基化基因参与了209条KEGGpathway，差异甲基化基因在不饱和脂肪酸的生物合成(Biosynthesisofunsaturatedfattyacids)中富集显著，涉及的KEGGpathway主要包括细胞过程(cellularprocesses)、环境信息处理(environmentalinformationprocessing)、遗传信息处理(geneticinformationprocessing)、人类疾病(humandiseases)、代谢(metabolism)、生物系统(organismalsystems)等。差异甲基化基因参与数目较多的KEGGpathway信号转导途径主要代谢途径(Metabolicpathways)、癌症途径(Pathwaysincancer)、PI3K-Akt信号通路(PI3K-Aktsignalingpathway)等。
调理脾胃针法干预后的脾虚湿盛型2型糖尿病肾病患者与干预前比较，存在1个低差异甲基化基因(NLK)分别参与了4条KEGGpathway，分别是黏着连接(Adherensjunction)、MAPK信号通路(MAPKsignalingpathway)、Wnt信号通路(Wntsignalingpathway)及FoxO信号通路(FoxOsignalingpathway)。
6.特定基因NLK在不同基因区段的甲基化变化水平存在差异。
四、调理脾胃针法对脾虚湿盛型2型糖尿病肾病患者基因NLK甲基化及mRNA表达验证
1.各实验组样本RNA抽提后，经NanoDrop分光光度计定量及Agilent2100生物分析仪电泳检测质检全部合格。各实验组样本DNA抽提后，经NanoDrop分光光度计定量及琼脂糖凝胶电泳质检全部合格。
2.实时定量PCR结果显示：调理脾胃针法干预前后及正常人组均能检测到NLKmRNA的表达和扩增，且扩增、溶解过程检测稳定。但脾虚湿盛型2型糖尿病肾病与正常人组NLKmRNA的表达水平比较，P＞0.05，表明无统计学意义；经调理脾胃针法干预后，NLK在的脾虚湿盛型2型糖尿病肾病患者中NLKmRNA与干预前比表达升高，但组间差异无统计学意义，P＞0.05。
3.焦磷酸测序验证结果显示：在各实验组样本中，基因NLK启动子区上存在的一个CpG位点均能检测到甲基化改变，脾虚湿盛型2型糖尿病肾病患者与正常人比较，NLK启动子区CpG岛发生了高甲基化改变，差异具有统计学意义，P＜0.05。经调理脾胃针法治疗后NLK启动子区CpG岛的甲基化程度降低，但降低程度与治疗前比较无统计学差异，P＞0.05。
4.基因NLK启动子区CpG岛甲基化水平与NLKmRNA表达水平的相关性分析结果显示：调理脾胃针法治疗前后的NLKmRNA表达水平与DNA甲基化水平之间未发现相关性。
结论：
1.调理脾胃针法能降低脾虚湿盛型2型糖尿病肾病患者的蛋白尿，对其2hPBG、糖化血红蛋白具有一定的改善作用；并能通过降低中性粒细胞数及NLR、升高淋巴细胞数，以增强患者的适应性免疫。
2.脾虚湿盛型2型糖尿病肾病患者存在T淋巴细胞亚群失衡及淋巴细胞DNA损伤。调理脾胃针法能调节T淋巴细胞亚群的平衡并修复淋巴细胞DNA氧化损伤，提高机体免疫功能，维持免疫稳态。
3.脾虚湿盛型2型糖尿病肾病患者的发病过程中存在DNA甲基化水平表达的异常，调理脾胃针法可能对基因NLK甲基化具有一定的调控作用。
4.脾虚湿盛型2型糖尿病肾病患者基因NLK的mRNA表达水平和启动子区CpG岛甲基化水平存在差异。调理脾胃针法对基因NLK启动子区CpG岛高甲基化的表达存在一定的改善趋势。