抗甲方颗粒治疗桥本氏甲状腺炎的药效学初步评价

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目的:本研究先后在Lewis大鼠和C57BL/6J小鼠上建立实验性自身免疫性甲状腺炎(Experimental autoimmune thyroiditis,EAT)动物模型,选用优甲乐和硒酵母片作为阳性对照药,开展抗甲方治疗EAT大、小鼠桥本氏甲状腺炎的药效学评价工作。以EAT大鼠模型为研究对象,观察抗甲方对大鼠甲状腺自身抗体水平、甲状腺组织形态学变化、外周血中T淋巴细胞分布比例、血清细胞因子分泌水平及甲状腺相关基因表达水平的影响,初步评估抗甲方的药效及潜在的作用机制。同时,通过构建EAT小鼠模型,观察抗甲方对小鼠甲状腺自身抗体水平及甲状腺组织形态学变化的影响,结合体外脾淋巴增殖实验的结果,进一步验证抗甲方具有的免疫调节作用,为其用于桥本氏甲状腺炎的治疗提供实验依据和思路借鉴。方法:构建EAT大鼠模型:选取雌性Lewis大鼠,除空白对照组和阴性对照组外,其余大鼠先接受皮下注射猪甲状腺球蛋白(Porcine thyroglobulin,PTg)抗原,开展免疫诱导造模,每周1次,持续8周。造模大鼠依据血清甲状腺过氧化物酶抗体(Thyroid peroxidase antibody,TPOAb)水平进行模型验证,并展开随区分组,设为模型组、抗甲方低、中、高剂量给药组、优甲乐组和硒酵母组,以每日灌胃给药方式,连续给药8周。整个试验期间,除空白对照组每日饮用纯水外,其余各组大鼠均饮用0.064%的高碘水,每日观察动物状态,每周记录大鼠体重变化。待实验终点,处死大鼠,分离获得血清,剥离甲状腺及脾脏组织。采用苏木精—伊红(Hematoxylin-eosin staining,HE)染色观察甲状腺组织病理变化,酶联免疫吸附试验测定法(Enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)检测血清中甲状腺自身抗体滴度、甲状腺激素水平以及细胞因子的含量,流式细胞仪检测外周血辅助性T淋巴细胞(helper T cell)包括Th1、Th2、Th17及调节性T细(Regulatory cells,Tregs)比例的动态变化,实时荧光定量PCR检测组织中T淋巴细胞因子及转录因子表达量的变化。构建EAT小鼠模型:选用C57BL/6J雌性小鼠,经皮下注射PTg抗原免疫诱导构建EAT小鼠模型。造模4周后,动物随机分为8组,开展灌胃给药,持续4周。待实验终点,各组小鼠眼眶取血,分离血清检测自身抗体滴度变化。采集甲状腺组织用于HE染色观察组织病理的变化。在无菌环境下分离脾脏,提取脾淋巴细胞,观察抗甲方对小鼠脾淋巴细胞增殖的影响,从体内、体外两个角度共同探究抗甲方治疗桥本氏甲状腺炎的潜在作用机制。结果:经过8周的给药治疗,抗甲方中、高剂量组可显著改善EAT大鼠由于免疫造模出现的体重消瘦和脾脏异常肿大的现象,同时,甲状腺自身抗体滴度和甲状腺激素水平也得以显著下降。此外,HE染色结果显示,抗甲方干预治疗后,大鼠甲状腺组织内滤泡细胞较模型组完整,胶质含量增多,淋巴细胞浸润明显减少,提示抗甲方给药可有效改善EAT大鼠表现出的桥本氏甲状腺炎症状。在细胞水平上,流式细胞的结果表明,EAT大鼠外周血中Th1、Th2、Th17细胞分布比例较空白组明显升高,而Treg细胞比例有所下降。同时,在细胞因子水平上,ELISA检测结果显示T淋巴细胞因子的变化趋势与流式结果相一致,两者协同表明EAT大鼠体内存在Th1/Th2,Th17/Treg的平衡偏移,而口服抗甲方能显著改善上述T淋巴细胞的失衡状态,提示其对HT模型动物具有免疫调节作用。此外,在基因水平上,模型组大鼠甲状腺组织中存在Th1细胞因子及其转录因子高表达,而Treg细胞因子及其转录因子低表达的现象,推测甲状腺组织中淋巴细胞的浸润主要由Th1细胞所介导。而口服抗甲方对Th1、Treg细胞均有调节作用,提示抗甲方可能通过下调T-bet m RNA的表达水平以抑制T淋巴细胞分化生成Th1细胞,上调TGF-β、Foxp3 m RNA的表达水平以加强Treg细胞的免疫抑制功能,从而减轻模型大鼠甲状腺部位淋巴细胞的浸润程度,起到改善甲状腺功能,保护甲状腺组织的作用。同样,研究也从EAT模型小鼠的血清中检测出高滴度的甲状腺自身抗体,镜检下观察到甲状腺组织中存在典型的淋巴细胞浸润,表明模型具有桥本氏甲状腺炎的特征。口服抗甲方能显著下调甲状腺自身抗体水平,抑制脾淋巴细胞增殖,减缓甲状腺组织肿胀和淋巴细胞浸润程度,提示抗甲方具有抑制机体过高的免疫应答反应,保护甲状腺组织,延缓疾病发展的作用。结论:本研究以构建的EAT大/小鼠模型为试验平台,从体内外两方面,通过整体药效水平、细胞水平和分子水平的分析,初步评价了口服抗甲方对桥本氏甲状腺炎的药效作用及可能涉及的起效机制。研究发现抗甲方能显著降低TPOAb、TGAb这两个桥本氏甲状腺炎特异性抗体的滴度水平,并减轻甲状腺组织中淋巴细胞的整体浸润程度,起到改善HT典型临床表现的药效作用。此外,研究还发现口服抗甲方可回调血清中甲状腺激素T3、T4的异常升高,表现出对甲状腺功能异常的调控作用,并能维持模型大鼠体重不过快下降,抑制脾脏肿大及体外脾淋巴细胞的增值,提示其具有调节机体整体免疫应答水平的保护作用。进一步的研究发现,上述药效作用与抗甲方可有效调节Th、Treg细胞的数量及功能,纠正Th1/Th2、Th17/Treg失衡的细胞比例有关,且该调节作用可能是通过影响转录因子T-bet、Foxp3的m RNA表达水平,从而下调甲状腺部位T淋巴细胞分化生成Th1细胞,加强Treg细胞的免疫抑制作用来实现的。
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