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目前,基因工程技术的发展使得多种重组蛋白药物成功地应用于临床治疗,并产生了巨大经济和社会效益。以大肠杆菌(E.coli)系统表达的重组蛋白已有上万多种,其中细胞中不溶性的表达,即以包涵体存在形式占到了 70-80%。包涵体的复性是获得高活性、高质量重组蛋白药物制备的“瓶颈”。众所周知,高效液相色谱(HPLC)法具有分离效果好、快速纯化蛋白质、适用性强和易于规模化制备的特点,在包涵体的复性与纯化中也占据了越来越重要的地位。但是,仍然存在的问题是包涵体在HPLC柱上的复性效率很低,难于达到规模化的制备。因此,在本工作中,我们合成一种以色氨酸为配基HPLC固定相,该固定相分别具有高效疏水相互作用色谱(HPHIC)模式和弱阳离子交换色谱(WCX)模式;考察这两种不同的HPLC模式下对蛋白质的分离能力,以及应用于鸡蛋清的分离和带有标签的RGD重组人Notch配体Delta-like 1(RGD-rhDll1)融合蛋白复性与同时纯化的研究。本论文包括以下四个部分:1.文献综述近年来,HPLC技术的研究与进展,使HPLC在生物大分子分离、变性蛋白复性与纯化中得到了广泛的应用,包括HPHIC法、HPIEC法、MMC法及其规模化制备中的应用。在这里将对以上的应用发展做以综述。2.色氨酸配基的高效液相色谱固定相的制备及其分离性能我们利用带有疏水基团和静电基团的色氨酸分子作为色谱固定相的配基,通过环氧化活化法将色氨酸直接键合于硅胶基质上,得到了具有高效疏水相互作用色谱(HPHIC)模式和弱阳离子交换色谱(WCX)模式的固定相。用固体荧光光谱法、元素分析表征该色氨酸配基的色谱固定相,考察两种HPLC模式下对标准蛋白的分离效果以及对天然蛋白鸡蛋清分离的结果显示,在HPHIC模式下,该固定相可以使五种标准蛋白(Cyt-c;RNase-A;Lys;α-Amy;Ins)达到基线分离;在WCX模式下,可以分离两种标准蛋白(RNaseA,Lys),并且在HPHIC模式下,可以一步从鸡蛋清中分离得到质量回收率为97.8%,纯度达到100%的溶菌酶。3.色氨酸配基的HPLC固定相对RGD-rhDll1的复性与纯化首先,将筛选的RGD-rhDll1工程菌在摇瓶中培养,获得的细胞菌体经超声波破碎、洗涤,离心回收包涵体,并溶解于8.0 moL/L脲得到变性抽提液;然后,利用已制备的色氨酸配基的固定相进行RGD-rhDll1复性与同时纯化的研究。在WCX模式下,考察了不同洗脱梯度,流动相pH对RGD-rhDll1复性与纯化的影响,结果,当平衡液pH为4,采用等度洗脱时,RGD-rhDll1可以保留,说明了该固定相具有一定的静电协同作用。另外,在HPHIC模式下,考察了不同洗脱梯度、流动相pH以及不同固定相对RGD-rhDll1柱上复性与同时纯化的影响。结果表明,当pH为7.5,流速为1.0 mL/min时,RGD-rhDll1的质量回收率可达68.6%,纯度达95.8%。4.色氨酸配基的HPHIC色谱饼对RGD-rhDll1的复性与纯化在本实验中,利用已经拥有自主产权的“色谱饼”对RGD-rhDll1进行复性并同时纯化放大工艺的研究。在HPHIC模式下,考察了流动相中不同浓度脲、负载量以及流速对RGD-rhDll1复性与纯化的影响。结果显示,在流动相中添加3.0mol/L脲,流速为2.0 mL/min,色谱载量为0.2 mL时,目标蛋白RGD-rhDll1的质量回收率和纯度分别为67.0%和 98.2%。