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目的
早年不良经历导致成年后精神障碍易感性的发病机制尚未完全清楚，HPA轴功能失调、神经可塑性降低及表观遗传学改变是主要的研究热点。近期发现免疫炎症反应在精神障碍发病中起着越来越重要的作用，早年不良经历者在遭受二次应激时会发生增强的炎症反应，影响神经发生和认知功能。母婴分离动物模型是早年不良经历致抑郁易感性病理生理机制研究的重要工具。前期研究显示，温阳解郁方对母婴分离小鼠造成的行为异常、HPA功能亢进、神经递质改变及神经可塑性降低有着良好的调节作用。因此，探索母婴分离对成年期小鼠大脑小胶质细胞的影响以及温阳解郁方干预对母婴分离小鼠大脑小胶质细胞变化的调节作用，可以为早年不良经历相关病症的早期防治提供思路。
方法
以小鼠出生为PD0，在PD5-PD14，进行8h/d的母婴分离复制动物模型(MS)，将正常处理的小鼠随机分为正常对照组(Ncontrol)、对照组(Control)，将经过母婴分离仔鼠随机分为母婴分离组(MS)、温阳组(Wenyang)、解郁组(Xiaoyao)、温阳解郁组(XSF)及氟西汀组(FLU)，在离乳至成年(3月龄)，Ncontrol、Control和MS分别饲喂正常饲料，其余各组给予相应的药混饲料(Wenyang用二仙汤2.52g/kg、Xiaoyao用逍遥散3.85g/kg、XSF用温阳解郁方5.25g/kg、FLU用氟西汀20mg/kg)喂养，直到PD90。
应激刺激实验：除Ncontrol外，其余各组均给予限制性应激：将小鼠装进透气的50ml离心管中限制活动，3h后放出自由活动，期间不予食物和饮水。2h后做行为学检测。
LPS刺激实验：除Ncontrol组腹腔注射同体积的生理盐水外，其余各组均腹腔注射LPS(5mg/kg溶于生理盐水)一次，7天后进行行为学检测。
通过旷场箱自由活动、O迷宫和社会交互认知行为实验检测，确定其行为模式。行为学实验结束24h后，灌注固定取脑，行连续病理切片，直接冰冻取脑，快速剥离海马、前额皮质、丘脑。采用免疫组织化学标记法，以Iba-1来标记小胶质细胞，通过Iba-1表达观察其大脑胶质小细胞形态学变化，采用Real-TimePCR检测MCP-1、IL-1Β、IL-6、TNF-α、Ym1、IL-10、Arg1、CD11b、IBA1、CD206、BDNF、GR、β-actin指标的mRNA表达量。
结果
温阳解郁方对母婴分离小鼠应激后大脑小胶质细胞的影响
1.与Ncontrol和Control比较，MS小鼠旷场自由活动5min运动总路程和30min中心区活动时间明显下降(P＜0.05)。XSF和FLU可显著升高MS小鼠5min活动总路程(P＜0.01)。O型迷宫中开臂活动时间MS组较Ncontrol组有明显降低(P＜0.05)，各用药组与MS组相比有明显上调(P＜0.05)，闭臂活动时间Control组较Ncontrol组相比有明显增加(P＜0.05)，活动总路程Control组和MS组较Ncontrol组有明显降低(P＜0.05)。相较于Ncontrol和Control，MS小鼠社会交互认知实验中训练探察时间和辨别探查时间都有显著延长(P＜0.05)，各给药组均有显著下调作用(P<0.05)，其中XSF和FLU下调的幅度比Wenyang和Xiaoyao大。
2.在炎症刺激下，Control和MS小鼠的小胶质细胞都发生了明显的改变，由分枝状变成了“阿米巴”样。在海马CA1区,ControlIba-1的IOD值较Ncontrol显著升高(P＜0.01)，MS较Control显著升高(P＜0.01)，各给药组较MS均显著下调(P＜0.01)。在下丘脑MS小鼠Iba-1IOD较Ncontrol、Control均显著升高(P＜0.01，P＜0.05)，Wenyang较MS明显下调(P＜0.05)，FLU较MS有显著下调作用(P＜0.01)。
3.在海马、前额皮质、丘脑区，相较于Ncontrol，Control和MS的BDNF和GR的mRNA表达量明显下降(P＜0.05)，各给药组均有上调的趋势，其中XSF和FLU的上调幅度较大。相较于Ncontrol，MS的TNF-α、Arg1和CD11b的mRNA表达量明显上升(P＜0.05)。在前额皮质区，相较于Ncontrol，MS的TNF-α、Iba-1、IL-1β、MCP-1、Arg1和CD206的mRNA表达量明显上升(P＜0.05)，各给药组均有明显的下调作用，其中XSF和FLU的下调幅度更加明显。在丘脑区，相较于Ncontrol和Control，MS的IL-1β和CD206的mRNA表达量明显上升(P＜0.05)，各给药组均有明显的下调作用(P＜0.05)。
温阳解郁方对母婴分离小鼠注射LPS刺激后大脑小胶质细胞的影响
1.在旷场自由活动中，与Ncontrol组比较，其它各组5min运动总路程都显著缩短(P＜0.01)，与Control组相比较MS组和各用药组也都显著缩短(P＜0.01)，各用药组与MS组也显著增多(P＜0.01)。与Ncontrol组比较，其它各组30min运动总路程都明显缩短(P＜0.05)，其中MS组显著缩短(P＜0.01)，各用药组与MS组也明显增多(P＜0.05)。相较于Ncontrol和Control，MS小鼠在社会交互认知实验中训练探察时间和辨别探查时间都有显著延长(P＜0.01)，各给药组均有显著下调作用(P<0.05)。O型迷宫中，MS组开臂活动时间较Ncontrol组明显缩短(P<0.05)，Xiaoyao、XSF及FLU有上调的趋势。活动总路程中与Ncontrol组比较，MS组显著缩短(P<0.01)，与Control组相比较，MS组明显缩短(P<0.05)。
2.在海马CA1区，Control和MS小鼠Iba-1IOD值较Ncontrol显著升高(P＜0.01)，MS小鼠较Control显著升高(P＜0.01)，各给药组较MS均显著下调(P＜0.01)；在下丘脑区，相较于Ncontrol，Control小鼠Iba-1IOD值明显升高(P＜0.05)，MS小鼠显著升高(P＜0.01)；相较于Control，MS小鼠Iba-1的IOD值显著升高(P＜0.01)；各用药组显著下调(P＜0.01)。在海马CA3区，Control和MS小鼠Iba-1IOD值较Ncontrol显著升高(P＜0.01)，MS小鼠较Control显著升高(P＜0.01)，XSF和FLU显著下调(P＜0.01)。
3.在海马、前额皮质、丘脑区，相较于Ncontrol，Control和MS的BDNF和GR的mRNA表达量都有下降的趋势，其中MS的下降幅度比Control大，各给药组均有上调的趋势，其中Xiaoyao和XSF对GR的mRNA表达量有明显的上调作用(P＜0.05)；相较于Ncontrol，Control和MS的TNF-α、IL-1β、IL-6、MCP-1和CD11b的mRNA表达量显著上升(P＜0.01)，Xiaoyao、Wenyang、Xiaoyao和FLU均有下调的作用，相较于Ncontrol，Control和MS的CD206、Arg1的mRNA表达量明显的上升趋势，没有显著的差异。各给药组均有下调的作用。在前额皮质区，相较于Ncontrol，Control和MS的TNF-α、IL-1β、IL-6、MCP-1和CD11b的mRNA表达量显著上升(P＜0.01)，Xiaoyao、Wenyang、Xiaoyao和FLU均有下调的作用。在丘脑区，相较于Ncontrol，Control和MS的TNF-α、IL-1β、IL-6、MCP-1和CD11b的mRNA表达量显著上升(P＜0.01)，Xiaoyao、Wenyang、Xiaoyao和FLU均有下调的作用，相较于Ncontrol，Control和MS的CD206、Arg1的mRNA表达量明显的上升趋势，没有显著的差异。各给药组均有下调的作用。
结论
1、随着机体的发育，母婴分离小鼠在成年后遭受二次应激时比正常小鼠行为反应更加激烈，抑郁焦虑样行为更加严重。
2、母婴分离小鼠遭受二次应激后脑内小胶质细胞被激活，释放促炎性细胞因子，提示免疫炎症反应可能是其遭受二次应激时发病机制之一。
3、通过预防给药，发现温阳解郁方预防干预对遭受二次应激的母婴分离小鼠大脑小胶质细胞功能状态变化有很好的调节作用，温阳解郁方与成年期母婴分离小鼠证候方证相合。提示对于早年不良经历者应及早进行干预治疗。
早年不良经历导致成年后精神障碍易感性的发病机制尚未完全清楚，HPA轴功能失调、神经可塑性降低及表观遗传学改变是主要的研究热点。近期发现免疫炎症反应在精神障碍发病中起着越来越重要的作用，早年不良经历者在遭受二次应激时会发生增强的炎症反应，影响神经发生和认知功能。母婴分离动物模型是早年不良经历致抑郁易感性病理生理机制研究的重要工具。前期研究显示，温阳解郁方对母婴分离小鼠造成的行为异常、HPA功能亢进、神经递质改变及神经可塑性降低有着良好的调节作用。因此，探索母婴分离对成年期小鼠大脑小胶质细胞的影响以及温阳解郁方干预对母婴分离小鼠大脑小胶质细胞变化的调节作用，可以为早年不良经历相关病症的早期防治提供思路。
方法
以小鼠出生为PD0，在PD5-PD14，进行8h/d的母婴分离复制动物模型(MS)，将正常处理的小鼠随机分为正常对照组(Ncontrol)、对照组(Control)，将经过母婴分离仔鼠随机分为母婴分离组(MS)、温阳组(Wenyang)、解郁组(Xiaoyao)、温阳解郁组(XSF)及氟西汀组(FLU)，在离乳至成年(3月龄)，Ncontrol、Control和MS分别饲喂正常饲料，其余各组给予相应的药混饲料(Wenyang用二仙汤2.52g/kg、Xiaoyao用逍遥散3.85g/kg、XSF用温阳解郁方5.25g/kg、FLU用氟西汀20mg/kg)喂养，直到PD90。
应激刺激实验：除Ncontrol外，其余各组均给予限制性应激：将小鼠装进透气的50ml离心管中限制活动，3h后放出自由活动，期间不予食物和饮水。2h后做行为学检测。
LPS刺激实验：除Ncontrol组腹腔注射同体积的生理盐水外，其余各组均腹腔注射LPS(5mg/kg溶于生理盐水)一次，7天后进行行为学检测。
通过旷场箱自由活动、O迷宫和社会交互认知行为实验检测，确定其行为模式。行为学实验结束24h后，灌注固定取脑，行连续病理切片，直接冰冻取脑，快速剥离海马、前额皮质、丘脑。采用免疫组织化学标记法，以Iba-1来标记小胶质细胞，通过Iba-1表达观察其大脑胶质小细胞形态学变化，采用Real-TimePCR检测MCP-1、IL-1Β、IL-6、TNF-α、Ym1、IL-10、Arg1、CD11b、IBA1、CD206、BDNF、GR、β-actin指标的mRNA表达量。
结果
温阳解郁方对母婴分离小鼠应激后大脑小胶质细胞的影响
1.与Ncontrol和Control比较，MS小鼠旷场自由活动5min运动总路程和30min中心区活动时间明显下降(P＜0.05)。XSF和FLU可显著升高MS小鼠5min活动总路程(P＜0.01)。O型迷宫中开臂活动时间MS组较Ncontrol组有明显降低(P＜0.05)，各用药组与MS组相比有明显上调(P＜0.05)，闭臂活动时间Control组较Ncontrol组相比有明显增加(P＜0.05)，活动总路程Control组和MS组较Ncontrol组有明显降低(P＜0.05)。相较于Ncontrol和Control，MS小鼠社会交互认知实验中训练探察时间和辨别探查时间都有显著延长(P＜0.05)，各给药组均有显著下调作用(P<0.05)，其中XSF和FLU下调的幅度比Wenyang和Xiaoyao大。
2.在炎症刺激下，Control和MS小鼠的小胶质细胞都发生了明显的改变，由分枝状变成了“阿米巴”样。在海马CA1区,ControlIba-1的IOD值较Ncontrol显著升高(P＜0.01)，MS较Control显著升高(P＜0.01)，各给药组较MS均显著下调(P＜0.01)。在下丘脑MS小鼠Iba-1IOD较Ncontrol、Control均显著升高(P＜0.01，P＜0.05)，Wenyang较MS明显下调(P＜0.05)，FLU较MS有显著下调作用(P＜0.01)。
3.在海马、前额皮质、丘脑区，相较于Ncontrol，Control和MS的BDNF和GR的mRNA表达量明显下降(P＜0.05)，各给药组均有上调的趋势，其中XSF和FLU的上调幅度较大。相较于Ncontrol，MS的TNF-α、Arg1和CD11b的mRNA表达量明显上升(P＜0.05)。在前额皮质区，相较于Ncontrol，MS的TNF-α、Iba-1、IL-1β、MCP-1、Arg1和CD206的mRNA表达量明显上升(P＜0.05)，各给药组均有明显的下调作用，其中XSF和FLU的下调幅度更加明显。在丘脑区，相较于Ncontrol和Control，MS的IL-1β和CD206的mRNA表达量明显上升(P＜0.05)，各给药组均有明显的下调作用(P＜0.05)。
温阳解郁方对母婴分离小鼠注射LPS刺激后大脑小胶质细胞的影响
1.在旷场自由活动中，与Ncontrol组比较，其它各组5min运动总路程都显著缩短(P＜0.01)，与Control组相比较MS组和各用药组也都显著缩短(P＜0.01)，各用药组与MS组也显著增多(P＜0.01)。与Ncontrol组比较，其它各组30min运动总路程都明显缩短(P＜0.05)，其中MS组显著缩短(P＜0.01)，各用药组与MS组也明显增多(P＜0.05)。相较于Ncontrol和Control，MS小鼠在社会交互认知实验中训练探察时间和辨别探查时间都有显著延长(P＜0.01)，各给药组均有显著下调作用(P<0.05)。O型迷宫中，MS组开臂活动时间较Ncontrol组明显缩短(P<0.05)，Xiaoyao、XSF及FLU有上调的趋势。活动总路程中与Ncontrol组比较，MS组显著缩短(P<0.01)，与Control组相比较，MS组明显缩短(P<0.05)。
2.在海马CA1区，Control和MS小鼠Iba-1IOD值较Ncontrol显著升高(P＜0.01)，MS小鼠较Control显著升高(P＜0.01)，各给药组较MS均显著下调(P＜0.01)；在下丘脑区，相较于Ncontrol，Control小鼠Iba-1IOD值明显升高(P＜0.05)，MS小鼠显著升高(P＜0.01)；相较于Control，MS小鼠Iba-1的IOD值显著升高(P＜0.01)；各用药组显著下调(P＜0.01)。在海马CA3区，Control和MS小鼠Iba-1IOD值较Ncontrol显著升高(P＜0.01)，MS小鼠较Control显著升高(P＜0.01)，XSF和FLU显著下调(P＜0.01)。
3.在海马、前额皮质、丘脑区，相较于Ncontrol，Control和MS的BDNF和GR的mRNA表达量都有下降的趋势，其中MS的下降幅度比Control大，各给药组均有上调的趋势，其中Xiaoyao和XSF对GR的mRNA表达量有明显的上调作用(P＜0.05)；相较于Ncontrol，Control和MS的TNF-α、IL-1β、IL-6、MCP-1和CD11b的mRNA表达量显著上升(P＜0.01)，Xiaoyao、Wenyang、Xiaoyao和FLU均有下调的作用，相较于Ncontrol，Control和MS的CD206、Arg1的mRNA表达量明显的上升趋势，没有显著的差异。各给药组均有下调的作用。在前额皮质区，相较于Ncontrol，Control和MS的TNF-α、IL-1β、IL-6、MCP-1和CD11b的mRNA表达量显著上升(P＜0.01)，Xiaoyao、Wenyang、Xiaoyao和FLU均有下调的作用。在丘脑区，相较于Ncontrol，Control和MS的TNF-α、IL-1β、IL-6、MCP-1和CD11b的mRNA表达量显著上升(P＜0.01)，Xiaoyao、Wenyang、Xiaoyao和FLU均有下调的作用，相较于Ncontrol，Control和MS的CD206、Arg1的mRNA表达量明显的上升趋势，没有显著的差异。各给药组均有下调的作用。
结论
1、随着机体的发育，母婴分离小鼠在成年后遭受二次应激时比正常小鼠行为反应更加激烈，抑郁焦虑样行为更加严重。
2、母婴分离小鼠遭受二次应激后脑内小胶质细胞被激活，释放促炎性细胞因子，提示免疫炎症反应可能是其遭受二次应激时发病机制之一。
3、通过预防给药，发现温阳解郁方预防干预对遭受二次应激的母婴分离小鼠大脑小胶质细胞功能状态变化有很好的调节作用，温阳解郁方与成年期母婴分离小鼠证候方证相合。提示对于早年不良经历者应及早进行干预治疗。