论文部分内容阅读
目的:糖尿病肾病(diabetic nephropathy,DN)是糖尿病最常见和最严重的微血管并发症之一,它已成为终末期肾功能衰竭(end-stage renal failer,ESRF)的主要原因之一,因此探索DN的发病机制及防治策略成为目前广大肾脏病学者关注的课题。DN的发病受多种因素影响,细胞外基质(extracellular matrix,ECM)降解、合成失调和重塑导致的肾小球硬化和肾小管间质纤维化是DN的主要病理表现,其中调控ECM代谢的ECM降解酶类的表达与活性异常发挥着重要的作用。Miyata等从人系膜细胞的基因表达库中分离出一种在系膜细胞优势表达的基因Megsin(mesangial cell-predominant gene with a homology to serpin),属丝氨酸蛋白酶抑制剂超家族。已有研究发现,其在以系膜细胞增生、系膜基质积聚为主要病理改变的糖尿病肾病中,其基因与蛋白表达水平显著上调。Megsin基因与蛋白的表达上调在糖尿病肾病发病机制中的作用尚不完全清楚。基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases,MMPs)是调控肾脏ECM代谢的一个重要的降解系统,包括明胶酶、间质胶原酶、基质溶素、弹力蛋白酶以及分泌型和膜型MMP等,它们的活性均依赖锌离子,活化的基质金属蛋白酶可以协同地降解多种ECM成分,其中MMP-2、MMP-9是起关键作用的酶。最近Ohtomo等研究发现,megsin能抑制MMP-2、MMP-9和纤溶酶的活性,megsin的特异性单克隆中和抗体能增强上述三者的活性,且作用机制与转化生长因子β(TGF-β)无直接关系。故探讨megsin在细胞外基质代谢中的作用对于深入揭示糖尿病肾病的发生机制具有重要意义。本研究拟通过体外培养肾小球系膜细胞(Mc),并采用细胞转染技术,对系膜细胞megsin基因的表达进行干预,观察高糖环境中megsin过表达和抑制状态下小鼠Mc中megsin、EMMPRIN、MMP-2、Ⅳ型胶原表达水平的变化,探讨高糖环境下megsin基因在ECM代谢过程中的作用,为进一步揭示糖尿病肾病的发病机制及寻找早期防治方法提供实验性理论依据。方法:将培养的小鼠肾小球Mc随机分为五组:即正常对照组:(A组,D-葡萄糖5.5mmol/L)、高糖组:(B组,D-葡萄糖30mmol/L)、高糖+空质粒组(C组,D-葡萄糖30mmol/L)、高糖+megsin质粒组:(D组,D-葡萄糖30mmol/L)、高糖+megsin siRNA组:(E组,D-葡萄糖30mmol/L)。大量提取已构建的空质粒、过表达megsin质粒和表达megsin siRNA质粒,按实验分组设计应用脂质体2000瞬时转染相应质粒(western blot法测定各组细胞megsin蛋白表达量以检测转染效率)并给予相应刺激,分别在培养12、24、48小时后收集细胞,采用免疫细胞化学和蛋白印迹(Western blot)方法测定Megsin、EMMPRIN、MMP-2的表达情况,用放免法测定各组细胞上清中Ⅳ型胶原的含量(结果用总蛋白校正)。结果:1免疫细胞化学结果显示:megsin表达于系膜细胞的胞浆中,A组有微弱表达,呈浅棕黄色。各时间点,B组megsin蛋白的表达量较A组升高,随时间延长表达逐渐增强,(p<0.01);C组与B组相比差异无显著性(P>0.05);与同时期C组相比,D组megsin蛋白水平升高明显,呈深棕黄色强表达,差异有显著性(p<0.01),E组megsin蛋白水平降低明显,差异有显著性(p<0.01)。EMMPRIN和MMP-2表达于系膜细胞的胞浆中,A组呈深棕黄色强表达。各时间点,B组EMMPRIN、MMP-2蛋白的表达量较A组降低,且随时间延长其表达被抑制(p<0.01),C组与B组相比差异无显著性(P>0.05);与同时期C组相比,D组EMMPRIN、MMP-2蛋白水平降低明显,有微弱表达,呈浅棕黄色,差异有显著性(p<0.01);E组EMMPRIN、MMP-2蛋白水平升高明显,差异有显著性(p<0.01)。2 Western blot结果显示:megsin在A组有少量表达,各时间点,B组的表达量较A组升高,且随时间延长其表达呈上升趋势(p<0.01);C组与B组相比差异无显著性(P>0.05);与同时期C组相比,D组megsin升高明显,差异有显著性(p<0.01),E组megsin降低明显,差异有显著性(p<0.01)。EMMPRIN和MMP-2在A组有大量表达,各时间点,B组EMMPRIN、MMP-2蛋白的表达量较A组降低,且随时间延长其表达呈下降趋势(p<0.01),48h时EMMPRIN、MMP-2水平降至最低;C组与B组相比差异无显著性(P>0.05);与同时期C组相比,D组EMMPRIN、MMP-2水平降低明显,差异有显著性(p<0.01),E组EMMPRIN、MMP-2水平升高明显,差异有显著性(P<0.01)。3放免法检测细胞上清液IV型胶原从12h开始,B组小鼠系膜细胞上清液中IV型胶原浓度(细胞总蛋白浓度校正)较A组开始升高,48h达到高峰(P<0.01);C组与B组相比差异无显著性(P>0.05);与同时期C组相比,D组IV型胶原浓度升高明显,差异有显著性(P<0.01),E组IV型胶原浓度降低明显,差异有显著性(P<0.01)。结论:1体外实验证实,高糖环境下培养的系膜细胞中megsin的表达增高,EMMPRIN和MMP-2表达降低,提示megsin、EMMPRIN和MMP-2在DN发生机制中起一定作用。2高糖状态下,系膜细胞过表达megsin导致EMMPRIN和MMP-2的表达下降,Ⅳ型胶原增加;转染megsin siRNA质粒对megsin基因进行干扰后megsin的表达降低,EMMPRIN和MMP-2的表达上升,Ⅳ型胶原减少。提示megsin促进早期DN发生的机制可能部分通过EMMPRIN影响MMP-2的表达,抑制Ⅳ型胶原降解,从而导致细胞外基质进行性堆积。3应用megsin RNA干扰技术可以缓解细胞外基质积聚的病理过程,为人类早期DN的防治提供了新思路。