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实验目的：通过不同发育阶段的甲状腺功能减退(甲减,hypothyroidism)大鼠模型和离体培养的大鼠海马神经元,观察甲状腺激素(thyroid hormone, TH)对生长激素(growth hormone, GH)、生长激素受体(growth hormone receptor, GHR)的表达和相关信号转导分子的影响,以及TH、GH对新生大鼠海马神经干细胞(neural stem cells, NSCs)分化的调控,阐明TH与GH在中枢神经系统发育过程中的生理功能及其相互关系。实验方法：1.检测GHR在海马神经元上的表达以及TH对海马神经元GH和GHR的表达及其信号转导的影响免疫荧光法观察GHR在原代培养的大鼠海马神经元上的表达；用不同浓度的T3处理原代培养神经元后,实验用不同浓度的T3 (3,5,3’-triiodo thyronine)处理后,采用real time PCR的方法观察GH/GHR/IGF-1 mRNA水平的变化；用一定浓度的GH、T3、Mab74.3(GH拮抗剂)分别或同时处理原代培养的大鼠海马神经元后,western blotting检测GH信号通路中的信号分子STAT5蛋白水平的变化。2.观察甲减对不同发育阶段大鼠的海马组织中GH信号转导的影响建立先天性甲减(congenital hypothyroidism, CHT)大鼠模型以及4W和8W龄甲减大鼠模型；real time PCR法检测不同周龄的甲减大鼠海马组织中GH和GHR mRNA水平的变化；western blotting方法观察大鼠海马组织中GH的信号分子(JAK2, P-JAK2, STAT5, P-STAT5)蛋白水平的变化。3.观察T3和GH对大鼠海马NSCs分化的影响及其相互关系在分离、纯化和鉴定了大鼠海马NSCs后,观察用不同浓度的T3处理96h对海马NSCs分化的影响,不同浓度的GH处理96h后对海马NSCs分化的影响,两种激素联合使用对NSCs分化的影响。实验结果：1.T3对GH及其信号转导分子STAT5蛋白水平的作用免疫组化结果表明,新生SD大鼠海马神经元胞膜上有丰富的GHR分布。原代培养的海马神经元在加入不同浓度的T3(0,2.5nM,5nM,10 nM)培养96小时后,GH和GHR mRNA水平有不同程度地变化。其中在5nM T3的培养条件下,GH和GHR mRNA较对照组明显升高(p<0.05)。但IGF-1 mRNA水平的变化无统计学意义(p>0.05)。新生大鼠海马神经元分别经过T3(5nM), GH(25ng/ml), T3(5nM)+GH (25ng/ml), T3 (5nM)+GH (25ng/ml)+Mab74.3 (5ng/ml)处理96小时后,Western blotting显示STAT5蛋白水平较对照组有不同程度的变化。T3(5nM)处理后新生大鼠海马神经元STAT5蛋白水平较对照组有升高趋势,但无统计学意义(p>0.05);GH(25ng/ml)处理后STAT5蛋白水平较对照组显著性升高(p<0.05)；T3 (5nM)+GH (25ng/ml)共同处理大鼠海马神经元后,STAT5蛋白水平较对照组升高,且有高度显著性差别(p<0.01)。但是经GHR的特异性阻断剂Mab74.3预处理后,再同时加入T3和GH培养,STAT5蛋白水平较对照组显著降低(p<0.05)。2.甲减对海马GH与GHR及信号分子蛋白水平的影响4W及8W龄甲减组大鼠的甲状腺相对重量(g/100g体重)较对照组显著增加(p<0.001)。血清FT3、FT4水平较对照组明显下降(均为p<0.001),TSH水平较正常对照组显著上升(p<0.001),说明甲减大鼠模型制备成功。CHT组仔鼠体重较对照组明显降低(p<0.001),CHT+T3组仔鼠体重较CHT组有明显回升(p<0.001),和对照组相比较无明显差异(p>0.05)。ELISA结果显示CHT组仔鼠血清T3和T4水平较对照组明显降低(均为p<0.001)；经T3处理后,其血清T3水平较CHT组有明显升高(p<0.001),几乎回升到对照组水平(p>0.05)。说明CHT大鼠模型制备成功,T3治疗效果明显。2W龄CHT组大鼠海马中GH和GHR mRNA水平较对照组大鼠显著降低(p<0.001),但经T3(5ug/100gBW)治疗6天后,CHT+T3组大鼠的GH和GHRmRNA水平较CHT组明显升高(p<0.05)；Western blotting同样显示CHT组海马中GH和GHR蛋白水平较对照组显著降低,经T3治疗后明显恢复；CHT组大鼠海马中JAK2、P-JAK2、STAT5、P-STAT5蛋白水平与对照组之间存在显著差异,经T3处理后有不同程度的恢复,但JAK2/P-STAT5的恢复仍不明显。HE染色和nissl染色结果显示7W龄CHT大鼠海马中神经元脱失严重,神经元结构破坏,而经过T3治疗后能得到相当程度的恢复。行为学测试结果显示7W龄CHT大鼠学习和记忆能力下降,T3治疗后也可得到一定程度的恢复。4W龄及8W龄甲减组大鼠海马组织中GH和GHR mRNA水平和正常对照组相比均无明显差异(p>0.05),但Western blotting显示,4周及8W龄甲减组大鼠海马中GH和GHR蛋白水平较正常对照组明显降低,GH信号通路上的大部分重要信号分子较对照组亦显著降低。3.GH和T3对海马NSCs分化的影响分散的海马NSCs和前体细胞,在加入30ng/ml GH培养96h后,βⅢ-tubulin阳性的神经元比例较对照组升高(p<0.05),神经细胞酸性蛋白(glial fibdllaryacidic protein, GFAP)阳性的星形胶质细胞比例较对照组稍有降低(p<0.05)；10ng/ml和90 ng/ml GH处理组神经元和星形胶质细胞的比例与对照组无明显差异。40nMT3处理后,神经元比例较对照组升高(p<0.05),星形胶质细胞比例较对照组稍降低(p<0.05)；10nMT3处理组神经元的比例也较对照组稍增加(p<0.05),星形胶质细胞的比例未见明显变化。5nM T3处理组均与对照组无明显统计学差异。10nM T3+10ng/ml GH联合处理组神经元比例较对照组显著升高(p<0.01),单独10nM T3组和单独10ng/ml GH组与联合处理组有明显差异(均为p<0.05)。而三组的星形胶质细胞比例与对照组均无明显差异。结论：本研究证实,TH可以上调大鼠海马组织中GH及其受体的表达,并促进GH信号转导、促进NSCs和前体细胞向神经元分化。在脑的发育期,这种上调作用呈现在转录和翻译两个水平；进入幼年期之后这种促进作用仅仅表现在翻译水平,提示TH促进脑的生长发育功能可能是通过GH介导而实现的。