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摘要：牛磺酸是一种带有氨基的磺酸，是人体所需营养成分之一。目前，牛磺酸广泛应用于乳制品、饮料、复合味精、豆制品、滋补品、营养液，还可用于水产、动物养殖饲料添加剂，洗涤剂中间体和化学剂等。它也是鱼虾类食品风味形成的呈味氨基酸。半胱氨酸双加氧酶是牛磺酸生物合成的两个限速酶之一，在牛磺酸的合成中起关键作用。本研究利用race PCR技术克隆到了凡纳滨对虾（Litopenaeus vannamei）的半胱氨酸双加氧酶 （L. vannamei cysteine dioxygenase， LvCDO）基因的全长序列，对其编码的蛋白的特性进行了分析。同时构建原核表达载体对其进行表达，获得可溶表达的LvCDO，并利用GST琼脂糖凝胶对其进行纯化，获得较纯的重组GST-LvCDO。另外还发现在盐度为15‰的养殖水体中， LvCDO在凡纳滨对虾的血淋巴细胞和肝胰腺细胞中有较高的转录水平，表明其调节渗透压方面具有一定功能。
关键词：凡纳滨对虾 牛磺酸 半胱氨酸双加氧酶 克隆 表达
中图分类号：Q781 文献标识码：A 文章编号：1672-5336（2015）08-0000-00
Abstract：Taurine is one of the necessary nutrients for animal. At Nowadays， taurine is widely used in dairy products， beverage， composite monosodium glutamate， bean products， tonic， nutrient solution， animal/aquaculture feed additive， animal， intermediates and chemical agents. It is also the delicious amino acid of fish and shrimp. Cysteine dioxygenase is one of the rate limiting enzyme in the biosynthesis of taurine. In this study， full-length of Litopenaeus vannamei cysteine dioxygenase gene （LvCDO） was obtained by race PCR. And then the characteristics of the LvCDO were analyzed. At the same time， prokaryotic expression vector was constructed to get soluble expression LvCDO， and it was purified by GST agarose. We also found that LvCDO was upregulated upon osmotic stress in haemocytes and hepatopancreas of L. vannamei.
Key words： Litopenaeus vanname； taurine； cysteine dioxygenase； clone； expression
牛磺酸（Taurine）是一种在动物界分布广泛的非蛋白氨基酸，在维持人体大脑正常生理功能、促进婴幼儿大脑的发育、维持正常的视觉功能、促进胆汁酸盐代谢、参与内分泌活动及提高人体免疫力等多个方面有重要功能[1-3]。近年来因作为婴幼儿食品及功能性饮料的营养添加剂而受到广泛关注[4-5]。
现有的研究表明水产动物一般含有较高浓度的牛磺酸，而水产动物所需的牛磺酸主要依靠自身合成或直接从饵料中摄取获得。鱼虾类食品因此成为人类补充牛磺酸的重要途径。不同种类的水产动物内源合成牛磺酸能力因其相关酶类的活性差异而不同，也因此造成其对外源性牛磺酸的需求的差别[6]。而对于水产动物而言，牛磺酸的生物合成中，最为重要的两个酶就是半胱次磺酸脱羧酶 （cysteine sulfinate decarboxylase， CSD） 和半胱氨酸双加氧酶 （cysteine dioxygenase， CDO） [7-9]。凡纳滨对虾是广受欢迎的一种食用对虾，除味道鲜美外其也是人体补充牛磺酸的一种重要食品[10]。然而目前关于凡纳滨对虾的CDO基因的相关研究仍未见报道，对其牛磺酸生物合成机制更是不清楚。为了研究凡纳滨对虾牛磺酸合成的机制，作者克隆了凡纳滨对虾牛磺酸合成的关键酶半胱氨酸双加氧酶 （L. vannamei CDO， LvCDO），并对其功能展开初步研究，为进一步理解凡纳滨对虾牛磺酸生物合成的机理奠定基础。
1 材料和方法
1.1 菌株和质粒
大肠杆菌Escherichia coli DH5，基因型supE44 lacU169 80 lacZ M15 hsdR recA1 endAgurA1 thi-1 relA1；大肠杆菌Escherichia coli BL21（DE3），基因型F-，ompT，hsdS（rBB-mB-），gal，dcm（DE3）为广东省食品工业研究所实验室保存。质粒pMD18为TaKaRa公司产品；质粒pGEX-4T-1为广东海洋大学惠赠。
1.2 试剂和仪器
1.2.1 主要试剂
主要试剂SMART? RACE cDNA扩增试剂盒、T4 DNA连接酶、LA Taq DNA聚合酶、SYBR? Green Master Mix： SYBR Premix Ex Taq II （Tli RNase H Plus）、SYBR PrimeScript? RT-PCR试剂盒（Perfect Real Time）、T4 DNA Ligase均为TaKaRa公司产品；限制性内切酶EcoR I、Not I为FERMENTERS公司产品；质粒提取试剂盒为OMEAG公司产品；GST琼脂糖凝胶为GE公司产品；预染蛋白Marker为Bio-Rad公司产品；总RNA提取试剂盒为QIAGEN公司产品；DNA marker （DL2000） 为东胜生物公司产品，其余常规试剂均为国产分析纯。 1.2.2 主要仪器
主要仪器设备LightCycler480荧光定量 PCR 仪：购自德国 Roche 公司；PCR仪为东胜生物公司制造；超声波破碎仪购自宁波新芝生物科技股份有限公司；E412951 型凝胶成像仪、EPS-300A 型数显双稳电泳仪，上海天能科技有限公司制造；离心机由德国 Eppendorf 公司生产；紫外分光光度计由美国 GE 公司生产；SW-CJ-1F 超净工作台由苏州安泰空气技术有限公司生产；THZ-C 型恒温摇床由广州深华生物技术有限公司生产。
1.3 LvCDO的race PCR
根据从NCBI数据库获得的有关LvCDO的表达序列标签序列（expressed sequence tag， EST） FE088656.1，设计两条5’race PCR引物和两条3’race PCR引物：
5’race cDNA文库及3’race cDNA文库为广东海洋大学惠赠，race PCR主要操作按照试剂盒说明书。琼脂糖凝胶电泳检测产物并对目的DNA利用胶回收试剂盒回收纯化，连接至pMD18载体，挑取阳性克隆送生物公司测序鉴定。
1.4 LvCDO的生物信息学预测
1.4.1 基本理化性质预测
通过race实验获得LvCDO的cDNA的全长序列，提交至NCBI数据库。利用DNAstar软件对其ORF、蛋白质相对分子质量、氨基酸组成、等电点等基本理化性质进行分析[11]。
1.4.2 系统进化树构建
将LvCDO的氨基酸序列提交至NCBI数据库中，利用网站工具软件BLAST程序进行同源性比对分析，进而利用MEGA 4.0进行多序列对比并利用邻接归并法（即N-J法）进行进化树构建[12]。供试物种为凡纳滨对虾Litopenaeus vannamei、致乏库蚊Culex quinquefasciatus XP_001870330、深裂眶锯雀Stegastes partitus XP_008292285、青鳉Oryzias latipes XP_004072247、爪蟾Xenopus laevis NP_001083506、赤拟谷盗Tribolium castaneum XP_008195816、日本鳗Anguilla japonica BAL22276、智人Homo sapiens CAA80552、家鼠Mus musculus NP_149026、黄牛Bos taurus NP_001029637、太平洋牡蛎Crassostrea gigas EKC28611、非洲象 Loxodonta africana XP_003404533、家猫Felis catus XP_003980715、原鸡Gallus gallus XP_424964和黑腹果蝇 Drosophila melanogaster AFH08164。
1.5 表达质粒pGEX-4T-1-LvCDO的构建及其表达
接着利用EcoR I、Not I切割此片段及pGEX-4T-1空载体个1μg，37℃酶切2h。之后电泳胶回收相应的核酸片段，并利用T4 DNA连接酶将其在16℃连接过夜并转化、挑取阳性克隆送生物公司测序鉴定。
经测序鉴定序列正确的克隆进行培养扩增，提取质粒，转化至大肠杆菌BL21 （DE3）， 再挑取菌落进行菌落PCR鉴定。选取阳性克隆先少量培养，然后按照1：100的比例转接扩大培养，待菌液呈轻摇有云雾状，加入IPTG （0.04mmol/L） 37℃诱导表达3 h。10000g 5 min离心收取菌体，加入含有PMSF的冷PBS重悬菌体4℃条件下进行超声波破碎10 min。接着4℃条件下10000g 离心15 min，收取上清。利用GST琼脂糖凝胶对上清中的GST-LvCDO蛋白进行吸附，利用含有10mM 还原型谷胱甘肽的洗脱液体洗脱目的蛋白，制备蛋白电泳样品进行蛋白电泳鉴定。
1.6 荧光定量PCR检测LvCDO的转录
于凡纳滨对虾养殖基地分别设置盐度约3‰ （当地正常养殖水体盐度）和15‰的养殖水体中饲养两组凡纳滨对虾，每组对虾各150条。在不同时间点两组对虾分别取血淋巴和肝胰腺样品；每个时间点样品分3个平行，每个平行含5条虾的相应组织，故一个时间点共取对虾15条对虾的血淋巴和肝胰腺样品。之后提取样品RNA，逆转录为cDNA，并进行荧光定量PCR检测LvCDO的转录水平。荧光定量PCR引物为：
2 结果分析
2.1 凡纳滨对虾LvCDO全长cDNA的获取
通过5’ race PCR，获得片段504 bp（图1A）；通过3’ race PCR，获得片段181bp（图1B）。与之前EST序列进行拼接，获得含poly（A）尾的LvCDO全长cDNA全长803 bp，含一个长609 bp的ORF，序列获取号KP325604。此ORF编码蛋白含202个氨基酸残基，命名为LvCDO。LvCDO分子23kDa，等电点pI6.08，含有一个经预测具有参与氧化还原过程功能的DUF1637结构域（图2）。同时利用SWISS-MODEL对LvCDO进行三维结构建模（图3）[13]。
2.2 CDO系统进化树分析
将蛋白质序列在NCBI上进行BLAST，获得13个其他物种的CDO蛋白序列，这些物种也即是本研究的供试物种。利用MEGA 4.0建立的系统进化树如图5所示，可以看出供试的14个物种的CDO被聚成3大类。凡纳滨对虾和太平洋牡蛎的CDO归为一类；赤拟谷盗、黑腹果蝇和致乏库蚊的CDO归为一类，而其他所试物种的CDO物种归一类（图5）。从蛋白序列的多序列对比看LvCDO与其他物种有较高的同源性（图4）；从进化地位上看，凡纳滨对虾与同为海洋无脊椎动物的太平洋牡蛎的CDO比较接近（图5）。这提示凡纳滨对虾CDO的功能应该与太平洋牡蛎的CDO相近。 2.3 重组质粒的表达和纯化
通过蛋白电泳检测，可见诱导表达的菌体在约45 kDa处有一明显的蛋白条带（图6）， 分子量大小与预测相符。pET32a-LvCDO质粒在大肠杆菌BL21（DE3）中表达的融合蛋白带有6×His标签，可利用GST琼脂糖进行纯化，从蛋白电泳检测结果看到洗脱液蛋白样品中具有一条45 kDa大小的条带（图6），与受诱导表达的目的蛋白相符，故判断所纯化到的蛋白即为融合表达的LvCDO， 且其至少部分为可溶性表达。
2.4 不同盐度条件下凡纳滨对虾中LvCDO的转录水平变化
凡纳滨对虾是一种广盐性对虾，可以在不同的盐度条件下生存，然而较高盐度的水体养殖的对虾相较与在低盐度水体中养殖的对虾有更好的口感，据推测这可能与不同盐度下游离氨基酸的数量和种类的不同有关，牛磺酸的含量高低也是原因之一。而作为牛磺酸生物合成的关键酶，CDO在面临渗透压胁迫时会做出响应，调整牛磺酸的生成速度[14]。因养殖水体盐度的变化而对表达量做出调整是CDO抗渗透压胁迫功能的一个体现。我们对LvCDO在不同盐度条件下的转录水平进行了检测分析。可以看到与在当地正常盐度的养殖水体中培养的凡纳滨对虾相比，在较高盐度养殖水体（盐度15‰）的凡纳滨对虾的血淋巴细胞和肝胰腺细胞中的LvCDO的转录水平均显著上调（图7）。
3 结语
利用NCBI上获得已知的LvCDO的EST序列，采用race PCR获得其两端未知序列，从而获得含有完整的LvCDO ORF基因序列，并对其所编码的蛋白质序列的理化特征进行了分析；同时也进行了蛋白质多序列对比和进化树分析。将其ORF序列构建原核表达载体，进行表达纯化，获得了较纯的GST-LvCDO融合蛋白。同时荧光定量PCR分析表明，LvCDO可在转录水平对渗透压胁迫做出响应，调节凡纳滨对虾牛磺酸的合成。这些研究为深入理解LvCDO的功能，揭开凡纳滨对虾牛磺酸的生物合成机制奠定了基础。
参考文献
[1]郜富权，樊宝良.牛磺酸合成限速酶基因的克隆及乳腺特异性表达载体的构建[J].黑龙江畜牧兽医，2013（09）： 5-7.
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[6] Xie， Z.G.， et al.， Effect of dietary taurine levels on growth performance and taurine content of Nibea albiflora larvae[J]. Aquaculture International， 2014. 22（6）： 1851-1862.
[7]Eppler， B. and R. Dawson， Cysteine sulfinate decarboxylase and cysteine dioxygenase activities do not correlate with strain-specific changes in hepatic and cerebellar taurine content in aged rats [J]. Mechanisms of Ageing and Development， 1999. 110（1-2）： 57-72.
[8] Hagiwara， A.， et al.， Branched-chain amino acids inhibit the TGF-beta-induced down-regulation of taurine biosynthetic enzyme cysteine dioxygenase in HepG2 cells [J]. Amino Acids， 2014. 46（5）： 1275-1283.
[9]Jurkowska， H.， et al.， Primary hepatocytes from mice lacking cysteine dioxygenase show increased cysteine concentrations and higher rates of metabolism of cysteine to hydrogen sulfide and thiosulfate [J]. Amino Acids， 2014. 46（5）： 1353-1365.
[10]Yue， Y.R.， et al.， The effect of dietary taurine supplementation on growth performance， feed utilization and taurine contents in tissues of juvenile white shrimp （Litopenaeus vannamei， Boone， 1931） fed with low-fishmeal diets [J]. Aquaculture Research， 2013. 44（8）： 1317-1325.
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[14]吕秋凤，董公麟，曹双 等.牛磺酸抗应激作用的研究进展[J].中国畜牧杂志，2014. 50（21）：78-81.
收稿日期：2015-04-25
作者简介：欧英杰（1982—），男（汉），广东饶平人，工程师，本科，研究方向：食品生物技术。
关键词：凡纳滨对虾 牛磺酸 半胱氨酸双加氧酶 克隆 表达
中图分类号：Q781 文献标识码：A 文章编号：1672-5336（2015）08-0000-00
Abstract：Taurine is one of the necessary nutrients for animal. At Nowadays， taurine is widely used in dairy products， beverage， composite monosodium glutamate， bean products， tonic， nutrient solution， animal/aquaculture feed additive， animal， intermediates and chemical agents. It is also the delicious amino acid of fish and shrimp. Cysteine dioxygenase is one of the rate limiting enzyme in the biosynthesis of taurine. In this study， full-length of Litopenaeus vannamei cysteine dioxygenase gene （LvCDO） was obtained by race PCR. And then the characteristics of the LvCDO were analyzed. At the same time， prokaryotic expression vector was constructed to get soluble expression LvCDO， and it was purified by GST agarose. We also found that LvCDO was upregulated upon osmotic stress in haemocytes and hepatopancreas of L. vannamei.
Key words： Litopenaeus vanname； taurine； cysteine dioxygenase； clone； expression
牛磺酸（Taurine）是一种在动物界分布广泛的非蛋白氨基酸，在维持人体大脑正常生理功能、促进婴幼儿大脑的发育、维持正常的视觉功能、促进胆汁酸盐代谢、参与内分泌活动及提高人体免疫力等多个方面有重要功能[1-3]。近年来因作为婴幼儿食品及功能性饮料的营养添加剂而受到广泛关注[4-5]。
现有的研究表明水产动物一般含有较高浓度的牛磺酸，而水产动物所需的牛磺酸主要依靠自身合成或直接从饵料中摄取获得。鱼虾类食品因此成为人类补充牛磺酸的重要途径。不同种类的水产动物内源合成牛磺酸能力因其相关酶类的活性差异而不同，也因此造成其对外源性牛磺酸的需求的差别[6]。而对于水产动物而言，牛磺酸的生物合成中，最为重要的两个酶就是半胱次磺酸脱羧酶 （cysteine sulfinate decarboxylase， CSD） 和半胱氨酸双加氧酶 （cysteine dioxygenase， CDO） [7-9]。凡纳滨对虾是广受欢迎的一种食用对虾，除味道鲜美外其也是人体补充牛磺酸的一种重要食品[10]。然而目前关于凡纳滨对虾的CDO基因的相关研究仍未见报道，对其牛磺酸生物合成机制更是不清楚。为了研究凡纳滨对虾牛磺酸合成的机制，作者克隆了凡纳滨对虾牛磺酸合成的关键酶半胱氨酸双加氧酶 （L. vannamei CDO， LvCDO），并对其功能展开初步研究，为进一步理解凡纳滨对虾牛磺酸生物合成的机理奠定基础。
1 材料和方法
1.1 菌株和质粒
大肠杆菌Escherichia coli DH5，基因型supE44 lacU169 80 lacZ M15 hsdR recA1 endAgurA1 thi-1 relA1；大肠杆菌Escherichia coli BL21（DE3），基因型F-，ompT，hsdS（rBB-mB-），gal，dcm（DE3）为广东省食品工业研究所实验室保存。质粒pMD18为TaKaRa公司产品；质粒pGEX-4T-1为广东海洋大学惠赠。
1.2 试剂和仪器
1.2.1 主要试剂
主要试剂SMART? RACE cDNA扩增试剂盒、T4 DNA连接酶、LA Taq DNA聚合酶、SYBR? Green Master Mix： SYBR Premix Ex Taq II （Tli RNase H Plus）、SYBR PrimeScript? RT-PCR试剂盒（Perfect Real Time）、T4 DNA Ligase均为TaKaRa公司产品；限制性内切酶EcoR I、Not I为FERMENTERS公司产品；质粒提取试剂盒为OMEAG公司产品；GST琼脂糖凝胶为GE公司产品；预染蛋白Marker为Bio-Rad公司产品；总RNA提取试剂盒为QIAGEN公司产品；DNA marker （DL2000） 为东胜生物公司产品，其余常规试剂均为国产分析纯。 1.2.2 主要仪器
主要仪器设备LightCycler480荧光定量 PCR 仪：购自德国 Roche 公司；PCR仪为东胜生物公司制造；超声波破碎仪购自宁波新芝生物科技股份有限公司；E412951 型凝胶成像仪、EPS-300A 型数显双稳电泳仪，上海天能科技有限公司制造；离心机由德国 Eppendorf 公司生产；紫外分光光度计由美国 GE 公司生产；SW-CJ-1F 超净工作台由苏州安泰空气技术有限公司生产；THZ-C 型恒温摇床由广州深华生物技术有限公司生产。
1.3 LvCDO的race PCR
根据从NCBI数据库获得的有关LvCDO的表达序列标签序列（expressed sequence tag， EST） FE088656.1，设计两条5’race PCR引物和两条3’race PCR引物：
5’race cDNA文库及3’race cDNA文库为广东海洋大学惠赠，race PCR主要操作按照试剂盒说明书。琼脂糖凝胶电泳检测产物并对目的DNA利用胶回收试剂盒回收纯化，连接至pMD18载体，挑取阳性克隆送生物公司测序鉴定。
1.4 LvCDO的生物信息学预测
1.4.1 基本理化性质预测
通过race实验获得LvCDO的cDNA的全长序列，提交至NCBI数据库。利用DNAstar软件对其ORF、蛋白质相对分子质量、氨基酸组成、等电点等基本理化性质进行分析[11]。
1.4.2 系统进化树构建
将LvCDO的氨基酸序列提交至NCBI数据库中，利用网站工具软件BLAST程序进行同源性比对分析，进而利用MEGA 4.0进行多序列对比并利用邻接归并法（即N-J法）进行进化树构建[12]。供试物种为凡纳滨对虾Litopenaeus vannamei、致乏库蚊Culex quinquefasciatus XP_001870330、深裂眶锯雀Stegastes partitus XP_008292285、青鳉Oryzias latipes XP_004072247、爪蟾Xenopus laevis NP_001083506、赤拟谷盗Tribolium castaneum XP_008195816、日本鳗Anguilla japonica BAL22276、智人Homo sapiens CAA80552、家鼠Mus musculus NP_149026、黄牛Bos taurus NP_001029637、太平洋牡蛎Crassostrea gigas EKC28611、非洲象 Loxodonta africana XP_003404533、家猫Felis catus XP_003980715、原鸡Gallus gallus XP_424964和黑腹果蝇 Drosophila melanogaster AFH08164。
1.5 表达质粒pGEX-4T-1-LvCDO的构建及其表达
接着利用EcoR I、Not I切割此片段及pGEX-4T-1空载体个1μg，37℃酶切2h。之后电泳胶回收相应的核酸片段，并利用T4 DNA连接酶将其在16℃连接过夜并转化、挑取阳性克隆送生物公司测序鉴定。
经测序鉴定序列正确的克隆进行培养扩增，提取质粒，转化至大肠杆菌BL21 （DE3）， 再挑取菌落进行菌落PCR鉴定。选取阳性克隆先少量培养，然后按照1：100的比例转接扩大培养，待菌液呈轻摇有云雾状，加入IPTG （0.04mmol/L） 37℃诱导表达3 h。10000g 5 min离心收取菌体，加入含有PMSF的冷PBS重悬菌体4℃条件下进行超声波破碎10 min。接着4℃条件下10000g 离心15 min，收取上清。利用GST琼脂糖凝胶对上清中的GST-LvCDO蛋白进行吸附，利用含有10mM 还原型谷胱甘肽的洗脱液体洗脱目的蛋白，制备蛋白电泳样品进行蛋白电泳鉴定。
1.6 荧光定量PCR检测LvCDO的转录
于凡纳滨对虾养殖基地分别设置盐度约3‰ （当地正常养殖水体盐度）和15‰的养殖水体中饲养两组凡纳滨对虾，每组对虾各150条。在不同时间点两组对虾分别取血淋巴和肝胰腺样品；每个时间点样品分3个平行，每个平行含5条虾的相应组织，故一个时间点共取对虾15条对虾的血淋巴和肝胰腺样品。之后提取样品RNA，逆转录为cDNA，并进行荧光定量PCR检测LvCDO的转录水平。荧光定量PCR引物为：
2 结果分析
2.1 凡纳滨对虾LvCDO全长cDNA的获取
通过5’ race PCR，获得片段504 bp（图1A）；通过3’ race PCR，获得片段181bp（图1B）。与之前EST序列进行拼接，获得含poly（A）尾的LvCDO全长cDNA全长803 bp，含一个长609 bp的ORF，序列获取号KP325604。此ORF编码蛋白含202个氨基酸残基，命名为LvCDO。LvCDO分子23kDa，等电点pI6.08，含有一个经预测具有参与氧化还原过程功能的DUF1637结构域（图2）。同时利用SWISS-MODEL对LvCDO进行三维结构建模（图3）[13]。
2.2 CDO系统进化树分析
将蛋白质序列在NCBI上进行BLAST，获得13个其他物种的CDO蛋白序列，这些物种也即是本研究的供试物种。利用MEGA 4.0建立的系统进化树如图5所示，可以看出供试的14个物种的CDO被聚成3大类。凡纳滨对虾和太平洋牡蛎的CDO归为一类；赤拟谷盗、黑腹果蝇和致乏库蚊的CDO归为一类，而其他所试物种的CDO物种归一类（图5）。从蛋白序列的多序列对比看LvCDO与其他物种有较高的同源性（图4）；从进化地位上看，凡纳滨对虾与同为海洋无脊椎动物的太平洋牡蛎的CDO比较接近（图5）。这提示凡纳滨对虾CDO的功能应该与太平洋牡蛎的CDO相近。 2.3 重组质粒的表达和纯化
通过蛋白电泳检测，可见诱导表达的菌体在约45 kDa处有一明显的蛋白条带（图6）， 分子量大小与预测相符。pET32a-LvCDO质粒在大肠杆菌BL21（DE3）中表达的融合蛋白带有6×His标签，可利用GST琼脂糖进行纯化，从蛋白电泳检测结果看到洗脱液蛋白样品中具有一条45 kDa大小的条带（图6），与受诱导表达的目的蛋白相符，故判断所纯化到的蛋白即为融合表达的LvCDO， 且其至少部分为可溶性表达。
2.4 不同盐度条件下凡纳滨对虾中LvCDO的转录水平变化
凡纳滨对虾是一种广盐性对虾，可以在不同的盐度条件下生存，然而较高盐度的水体养殖的对虾相较与在低盐度水体中养殖的对虾有更好的口感，据推测这可能与不同盐度下游离氨基酸的数量和种类的不同有关，牛磺酸的含量高低也是原因之一。而作为牛磺酸生物合成的关键酶，CDO在面临渗透压胁迫时会做出响应，调整牛磺酸的生成速度[14]。因养殖水体盐度的变化而对表达量做出调整是CDO抗渗透压胁迫功能的一个体现。我们对LvCDO在不同盐度条件下的转录水平进行了检测分析。可以看到与在当地正常盐度的养殖水体中培养的凡纳滨对虾相比，在较高盐度养殖水体（盐度15‰）的凡纳滨对虾的血淋巴细胞和肝胰腺细胞中的LvCDO的转录水平均显著上调（图7）。
3 结语
利用NCBI上获得已知的LvCDO的EST序列，采用race PCR获得其两端未知序列，从而获得含有完整的LvCDO ORF基因序列，并对其所编码的蛋白质序列的理化特征进行了分析；同时也进行了蛋白质多序列对比和进化树分析。将其ORF序列构建原核表达载体，进行表达纯化，获得了较纯的GST-LvCDO融合蛋白。同时荧光定量PCR分析表明，LvCDO可在转录水平对渗透压胁迫做出响应，调节凡纳滨对虾牛磺酸的合成。这些研究为深入理解LvCDO的功能，揭开凡纳滨对虾牛磺酸的生物合成机制奠定了基础。
参考文献
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收稿日期：2015-04-25
作者简介：欧英杰（1982—），男（汉），广东饶平人，工程师，本科，研究方向：食品生物技术。