论文部分内容阅读
摘 要：目的 利用响应面法对超声提取酸枣仁皂苷的工艺条件进行了优化。方法 在对乙醇浓度、超声温度、超声时间、超声功率、料液比等单因子实验的基础上，根据Box-Behnken的中心组合设计原理选取乙醇浓度、超声温度、超声功率三个对酸棗仁皂苷提取影响比较大的因素，采用三因素三水平的响应面分析方法，然后对各因子显著性和交互作用进行分析，结果 得出了超声提取酸枣仁皂苷的最佳工艺条件为：乙醇体积分数69.8%，液料比12：1，超声温度44.6℃，超声功率74.1w，超声时间40min，及此时酸枣仁皂苷的实际产量为321.09μg/g。结论 该方法可用于对酸枣仁皂苷的提取。
关键词：响应面法；超声提取；酸枣仁皂苷；高效液相色谱法
Abstract： Objective Optimization of ultrasonic extraction for jujuboside from semen ziziphi spinose by response surface methodology（RSM）. Methods The single factor experiments were used on the basis of ethanol concentration， ultrasonic temperature， ultrasonic time， ultrasonic power and the ratio of liquid to solid that selected 3factors of jujuboside relatively large on extraction effects. According to the Box-Behnken of central composite experimental design principles， the response surface method with 3 factors and 3 levels was adopted. Results The results showed that the optimum conditions were that ethanol concentration of 69.8%， the ratio of solvent to solid of 12：1， ultrasonic temperature of 44.6℃， ultrasonic power of 74.1w， and ultrasonic time of 40min， Under such conditions the actual extraction yield of jujuboside could be up to 321.09 μg/g. Conclusion This method can be used to extract jujuboside from semen ziziphi spinose.
Key word： response surface method（RSM）； ultrasonic extraction； jujuboside； HPLC
响应面法（Response Surface Methodology， RSM）是利用合理的试验设计，应用多元二次回归方程拟合因素与响应值之间的函数关系，通过对多元二次回归方程以及对所得多项式的响应面和等高线进行分析，研究因子与响应面、因子与因子之间的相互关系，寻求最优工艺参数，是解决多变量问题的一种统计方法，适用于多因素实验设计[1]。它与过去广泛使用的“正交试验设计法”不同，具有精度高、预测性好、能研究几种因素间的交互作用等优点[2]，广泛地应用于农业、生物、食品、化学等领域。
酸枣仁（Semen Zizyphi Spinosde）为鼠李科植物酸枣（Ziziphus spinosa Hu）的干燥成熟种仁，其味酸性平，归心，脾，肝，胆四经，具有补肝宁心、镇静安神、敛汗、生津之功效。中医常作为养心安神药，主要用于治疗虚烦不眠，惊悸多梦，体虚多汗，津伤口渴等症[3]。药理学研究亦证实，酸枣仁中的皂苷对各种病因引起的失眠症和神经衰弱症均有良好的效果，是一种安全有效的天然镇静安眠药。
酸枣仁皂苷是酸枣仁的主要有效成分，其中主要含有酸枣仁皂苷A、B。酸枣仁皂苷属于四环三萜类皂苷。酸枣仁皂苷是酸枣仁镇静催眠作用的主要成分之一，对睡眠的改善有很好的效果。现代还有研究表明，酸枣仁皂苷A、B可提高SOD的活性，具有抗脂质过氧化作用，抗心肌缺血，可抑制动脉粥样硬化的形成和发展，对缺血性脑损伤有保护作用[4]。
本实验通过考查乙醇浓度、温度、超声功率等工艺参数，采用Box-Behnken响应面法进行工艺优化，应用Design-Expert7.00软件进行数据拟合。酸枣仁皂苷A中在皂苷的含量最高，因此本文应用酸枣仁皂苷A含量为指标，研究了超声法提取酸枣仁中酸枣仁皂苷的工艺条件。
1 仪器、试剂与材料
Waters 1525HPLC仪（美国Waters科技有限公司）；色谱柱为Luna C18（2） 5u 150x4.6mm（上海肯强贸易有限公司）；FZ102微型植物粉碎机（天津泰斯特仪器有限公司）；FA2104N电子分析天平（安徽东南仪诚实验室设备有限公司）；KQ2200DV型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；TGL-16G高速离心机（上海安亭科学仪器厂）；旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂）；循环水式真空泵（巩义市英峪予华仪器厂）；GZX-9070数显鼓风干燥箱、HHS型电热恒温水浴锅（上海博讯实业有限公司）。
酸枣仁药材购于武汉生达新世纪大药房（由本室鉴定），酸枣仁皂苷A标准品（纯度约为98%）购于上海锐聪科技发展有限公司。石油醚、乙醇、正丁醇、氨水等试剂均为分析纯，乙腈、甲醇为色谱纯，实验用水为蒸馏水，高效液相色谱用水为娃哈哈饮用纯净水。 2 试验方法
2.1 原料的处理与保存
酸枣仁中药材粉碎过40目筛，阴凉通风处保存。
2.2 色谱条件[5，6]
色谱柱：Luna C18反相柱（150x4.6 mm）；流動相：最初5 min为乙腈-水（20：80），5～20 min内乙腈浓度（体积分数，下同）梯度上升为70%，20～22 min乙腈浓度梯度回到20%。流速：1 mL/min；进样量：20 μl；检测波长：203 nm；柱温：25℃。梯度洗脱程序见表1
表1梯度洗脱程序
2.3 酸枣仁皂苷A含量测定[7，8]
2.3.1 对照品溶液的制备
精密称取酸枣仁皂苷A标准品20 mg，置于10 mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，得2 mg/mL的溶液备用。分别吸取备用液5 μl、25 μl、50 μl、100 μl、200 μl、300 μl、400 μl，分别用甲醇稀释至1 mL，摇匀，配制成1～7号样品。各种标准溶液酸枣仁皂苷A含量见表2。
取上表中的7个不同浓度的标准溶液按上述色谱条件分别进样20 μl，以峰面积积分值为纵坐标，酸枣仁皂苷A浓度为横坐标，绘制标准曲线，并计算回归方程Y=5487.5X-6993.4，r=0.9997。结果表明，酸枣仁皂苷A在10～800μg/mL
范围内有良好的线性关系。
A
B
图1 HPLC色谱图
A：酸枣仁皂苷A标准品B：酸枣仁提取物样品 1：酸枣仁皂苷A
Fig.1 HPLC chromatogram map
A： Standard of jujuboside A；B： Extract sample of semen ziziphi spinose； 1：Jujuboside A
2.3.2 供试品溶液的制备及分析[9]
精密称取酸枣仁粉末约5g，按一定的实验设计超声提取2次，合并提取液，旋转蒸发浓缩，得乙醇提取物。将乙醇提取物用20ml水超声溶解2次，合并提取液，用水饱和的正丁醇萃取3次，每次20ml，合并正丁醇提取液，用正丁醇饱和氨水10ml洗涤1次，洗液弃去，正丁醇提取液置旋转蒸发仪上减压蒸干，残渣用甲醇溶解，定量转移至10ml容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，备用。过0.2μm滤膜，采用HPLC测定，记录峰面积，并折算成1g酸枣仁中酸枣仁皂苷A的含量，各样品取测定结果平均值。
3 结果与讨论
3.1 单因素试验[10，11，12.13]
3.1.1乙醇浓度（体积分数，下同）对酸枣仁皂苷A提取率的影响
精密称取酸枣仁粉末约5 g各5份，提取温度50℃，液料比12：1（ml：g下同），提取时间40min，提取2次，提取功率70w，考察不同乙醇浓度对酸枣仁皂苷A提取率的影响，结果见图2。
由图2可以看出，乙醇浓度在0～95%范围内，随着乙醇浓度的升高，提取溶剂对物料的渗透能力增强，酸枣仁皂苷A的溶解度升高，但当乙醇浓度大于70%后，随着溶剂极性的降低，酸枣仁皂苷A溶解度下降，提取率降低。得知在乙醇浓度在70%附近有较高的提取率，因此乙醇浓度选70%。
3.1.2 温度对酸枣仁皂苷A提取率的影响
精密称取酸枣仁约5 g各5份，乙醇浓度70%，液料比12：1，提取时间40 min，提取2次，提取功率70w，考察提取温度对酸枣仁皂苷A提取率的影响，结果见图3。
由图3可以看出，当提取温度较低时，水溶性差的酸枣仁皂苷即使在萃取剂的作用下也难以发生相的转移而进入液相中。在相同条件下，当提取温度上升时，扩散系数增大，提取剂的渗透能力也相应增强，使所提取的有效成分浸出速率增大。但由于温度超过50℃，酸枣仁皂苷提取率变化不大，实验过程考虑到能耗问题，故选取50℃时为最佳提取温度。
3.1.3 液料比对酸枣仁皂苷A提取率的影响
精密称取酸枣仁粉末约5 g各5份，乙醇浓度70%，提取温度50℃，提取时间40 min，提取2次，提取功率70%，考察料液比对酸枣仁皂苷A提取率的影响，结果见图4。
由图4可以看出，溶剂量的增加提高了物料体系与提取剂体系间酸枣仁皂苷的质量浓度差，并减少了物料中有效成分的残余量，从而提高提取率。溶剂量超过12倍，提取率变化不明显，考虑成本问题，故液料比选取12倍。
3.1.4 时间对酸枣仁皂苷A提取率的影响
精密称取酸枣仁粉末约5 g各5份，乙醇浓度70%，提取温度50℃，液料比12：1，提取2次，提取功率70%，考察提取时间对酸枣仁皂苷A提取率影响，结果见图5。
由图5可以看出，提取时间的延长有利于有效成分的溶出，但时间过长则会引起有效成分的降解，提取率下降。故提取时间选取40 min。
3.1.5 超声功率对酸枣仁皂苷A提取率的影响
精密称取酸枣仁粉末约5 g各4份，乙醇浓度70%，提取温度50℃，液料比12：1，提取时间40 min，提取2次，考察提取功率对酸枣仁皂苷A提取率的影响，结果见图6。
由图6可以看出，超声功率从40%增大到70%时，皂苷A含量有所增高，超过70%后，含量下降。原因可能是随着超声功率的提高，加强了胞内物质的释放、扩散及溶解，从而提高了提取物的含量，随着超声功率的进一步提高，酸枣仁中的杂质溶出，从而降低了总皂苷A的含量。故超声功率选70%。 3.2 响应面分析实验[14，15，16]
综合考虑单因子试验结果，根据Box-Behnken的中心组合设计原理，选取乙醇浓度、超声温度、超声功率三个对酸枣仁皂苷A提取影响比较显著的的因素，采用三因素三水平的响应面分析方法，根据单因素试验结果选取因素水平。试验因素与水平设计见表3。实验设计与实验结果见表4，表5。
表3：Box-Benhnken实验因素及水平表
表4 响应面试验设计与试验结果
Tab.4： Experiment design and results of response surface methodology
在17个试验中， 1～12是析因试验，13～15是中心试验，用来估计试验误差，试验结果见表4。利用Design-Expert软件对表4响应值与各因素进行二次多元回归拟合后，得到回归方程：
皂苷含量=
310.35-15.72A+8.45B+12.0C+10.69AB+5.22AC+6.15BC-34.43A2-52.63B2-27.89C2
对上述回归模型进行方差分析（见表5），回归方程中各变量对指标（响应值）影响的显著性，由F检验来判定，概率P的值越小，则相应变量的显著程度越高。由表5可以看出，各因素中，显著的因素有B、C，即超声提取的温度和功率。回归模型也是高度显著的（P=0.0056）， 回归模型的决定系数为0.9134，说明该模型能够解释91.34%的变化，因此可用此模型对酸枣仁皂苷提取率进行分析和预测。
3.3 酸枣仁皂苷A提取率的响应面优化[17，18，19]
利用Design-Expert软件对表4数据进行二次多元回归拟合，所得到的二次回归方程的响应面及其等高线见图7～9。
从图7等高线图可以直观地看出，在功率为超声功率为70w时，乙醇浓度和提取温度对酸枣仁皂苷提取的交互作用不显著。因为等高线的形状反映出交互效应的强弱大小，椭圆形表示两因素交互作用显著，而圆形则与之相反[20]。乙醇浓度较低时，适当提高温度可以提高酸枣仁皂苷的提取率，由曲面图可以看出，在一定的乙醇浓度范围内，随着乙醇浓度的增大，酸枣仁皂苷的提取率增加，超过一定的乙醇浓度后，皂苷的提取率反而有所下降，这表明，在本试验水平范围内，适当提高乙醇浓度有利于皂苷的浸出，但乙醇浓度过高，溶剂极性变小，不利于酸枣仁皂苷的提取。
Fig.7 Response surface plot showing the effects of extraction ethanol concentration and ultrasonic temperature on extraction yield of jujuboside A
提取温度为50℃时，乙醇浓度和超声功率的交互作用显著（图8）。乙醇浓度60%时，要得到较高产量必须加大功率，而乙醇浓度70%时，较低的功率就能达到较高的产量。由此可见，适当增加功率，降低乙醇浓度，可提高皂苷的产量。
乙醇浓度70%时，超声温度和超声功率较显著（图9）。提取温度较低时，增大功率就能提高皂苷提取产量，功率较低时，要的到较高的提取产量必须提高温度，由此可见，适当降低温度，增大超声功率，可提高酸枣仁皂苷的提取产量。
图9 温度和功率交互作用对酸枣仁皂苷提取产量的影响
Fig.9 Response surface plot showing the effects of extraction ultrasonic temperature and ultrasonic power on extraction yield of jujuboside A
3.4 验证性试验
通过对酸枣仁皂苷提取产量的二次多项数学模型解逆矩阵，得出酸枣仁皂苷在乙醇浓度为69.8%，超声温度为44.6℃，超声功率为74.1w工艺条件下，提取的酸枣仁皂苷A含量预测值为324.719μg/g。验证性试验表明，在此条件下的提取产量比单因素组合最佳提取条件高出2.57%。
表6 试验结果的验证
4 结论
本研究用Box-Benhnken中心组合实验设计和响应面分析法对酸枣仁皂苷的提取工艺参数进行了优化，建立的二次多项数学模型具有显著性（P=0.0056），决定系数为0.9134。由模型解逆矩阵得到最佳工艺条件：在乙醇浓度为69.8%，超声温度为44.6℃，超声功率为74.1w工艺条件下，提取的酸枣仁皂苷A含量预测值为324.719 μg/g。实际提取产量为321.09 μg/g。
参考文献
[1] 海洪，汪坤，金文英，等.Box-Behnken響应面法优化超声波提取蚕沙中叶绿素的工艺研究[J]食品工业科技，2009，30（3）：207～209
[2] Annudurai G， Sheeja R Y. Use of Box-Behken design of experiments for the adsorption of verofix-red using biopolymer[J].Bioprocess Eng，1998，18：463～466
[3] 张永军，唐玉海，刘宏浪，等.酸枣仁总皂苷的提取工艺研究[J].西北药学杂志，2001， 16（ 1）：18. [4] 高聲传，郭涛，夏维杰，等.比色法测定酸枣仁提取物中总皂苷的含量[J].实用药物与临床，2005，8（1）：15～16
[5] 周庆武，李玲玲，纪标，等. RP-HPLC测定酸枣仁颗粒中酸枣仁皂苷A、B含量[J].中成药，2008，30（6）：16～17
[6] Mingchun Zhang， Yanqing Zhang， Junbo Xie. Simultaneous determination of jujuboside A， B and betulinic acid in semen Ziziphi spinosae by high performance liquid chromatography-evaporativelight scattering detection[J]. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis ， 2008，48：1467～1470
[7] 李玉娟，车振涛，毕开顺，等.反相高效液相法测定酸枣仁中酸枣仁皂苷A的含量[J].中国中药杂志，2001，26（5）309～310
[8] 房信胜，王建华，祝丽香等.微波辅助提取酸枣仁皂苷A的工艺优化[J].林产化学与工业，2010，30（1）：92～96
[9] 吴玉兰，丁安伟，包贝华.炒酸枣仁中酸枣仁皂苷的提取纯化工艺研究[J].中药材，2005，28（3）：219～223
[10] 王琪，张名位，孙远明，等.苦瓜皂苷的超声-微波协同提取工艺优化[J].广东农业科学，2009，6：120～123
[11] 李健，陈姝娟，张若男.超声辅助溶剂法提取肉桂总皂苷工艺的研究[J].食品科学，2008，29（04）：177～180
[12] 吴莉莉，孟庆艳，刘圆.红毛五加茎皮中总皂苷超声提取工艺研究[J]西南民族大学学报 自然科学版，2007，33（3）：535～537
[13]刘良坡，李爱锋，孙爱玲等.响应面分析方法优化超声提取桅子苷工艺研究[J].四川中医，2009，27（3）：46～48
[14] 雷恒，汪芳安，李永丽等.响应面法优化红曲色素的提取工艺及其稳定性研究[J].食品工业科技，2010，31（6）：283～286
[15]范龚键，韩永斌，顾振新.用响应面法优化红甘蓝色素提取工艺参数[J].南京农业大学学报，2006，29（1）：103～107
[16]邓洁红，谭兴和，郭时印等.响应面法优化刺葡萄皮色素提取工艺参数[J].湖南农业大学学报（自然科学版）.2007.33（6）：694～699
[17]海洪，汪坤，金文英等.Box-Behnken响应面法优化超声波提取蚕沙中叶绿素的工艺研究[J].食品工业科技，2009，30（3）：207～209
[18]王世磊. Design-Expert软件在响应面优化法中的应用.郑州大学
[19]赵鹏，李稳宏，李东等.响应面法优化金银花多糖超声提取工艺研究[J].食品科学，2009，30（20）：151～154
[20] Muralidhar R V， Chirumamila R R， Marchant R. et al.A response surface approach for the comparison of lipase production by Candida cylindracea using two different carbon sources[J].Biochem Eng J， 2001，9： 17～23.
关键词：响应面法；超声提取；酸枣仁皂苷；高效液相色谱法
Abstract： Objective Optimization of ultrasonic extraction for jujuboside from semen ziziphi spinose by response surface methodology（RSM）. Methods The single factor experiments were used on the basis of ethanol concentration， ultrasonic temperature， ultrasonic time， ultrasonic power and the ratio of liquid to solid that selected 3factors of jujuboside relatively large on extraction effects. According to the Box-Behnken of central composite experimental design principles， the response surface method with 3 factors and 3 levels was adopted. Results The results showed that the optimum conditions were that ethanol concentration of 69.8%， the ratio of solvent to solid of 12：1， ultrasonic temperature of 44.6℃， ultrasonic power of 74.1w， and ultrasonic time of 40min， Under such conditions the actual extraction yield of jujuboside could be up to 321.09 μg/g. Conclusion This method can be used to extract jujuboside from semen ziziphi spinose.
Key word： response surface method（RSM）； ultrasonic extraction； jujuboside； HPLC
响应面法（Response Surface Methodology， RSM）是利用合理的试验设计，应用多元二次回归方程拟合因素与响应值之间的函数关系，通过对多元二次回归方程以及对所得多项式的响应面和等高线进行分析，研究因子与响应面、因子与因子之间的相互关系，寻求最优工艺参数，是解决多变量问题的一种统计方法，适用于多因素实验设计[1]。它与过去广泛使用的“正交试验设计法”不同，具有精度高、预测性好、能研究几种因素间的交互作用等优点[2]，广泛地应用于农业、生物、食品、化学等领域。
酸枣仁（Semen Zizyphi Spinosde）为鼠李科植物酸枣（Ziziphus spinosa Hu）的干燥成熟种仁，其味酸性平，归心，脾，肝，胆四经，具有补肝宁心、镇静安神、敛汗、生津之功效。中医常作为养心安神药，主要用于治疗虚烦不眠，惊悸多梦，体虚多汗，津伤口渴等症[3]。药理学研究亦证实，酸枣仁中的皂苷对各种病因引起的失眠症和神经衰弱症均有良好的效果，是一种安全有效的天然镇静安眠药。
酸枣仁皂苷是酸枣仁的主要有效成分，其中主要含有酸枣仁皂苷A、B。酸枣仁皂苷属于四环三萜类皂苷。酸枣仁皂苷是酸枣仁镇静催眠作用的主要成分之一，对睡眠的改善有很好的效果。现代还有研究表明，酸枣仁皂苷A、B可提高SOD的活性，具有抗脂质过氧化作用，抗心肌缺血，可抑制动脉粥样硬化的形成和发展，对缺血性脑损伤有保护作用[4]。
本实验通过考查乙醇浓度、温度、超声功率等工艺参数，采用Box-Behnken响应面法进行工艺优化，应用Design-Expert7.00软件进行数据拟合。酸枣仁皂苷A中在皂苷的含量最高，因此本文应用酸枣仁皂苷A含量为指标，研究了超声法提取酸枣仁中酸枣仁皂苷的工艺条件。
1 仪器、试剂与材料
Waters 1525HPLC仪（美国Waters科技有限公司）；色谱柱为Luna C18（2） 5u 150x4.6mm（上海肯强贸易有限公司）；FZ102微型植物粉碎机（天津泰斯特仪器有限公司）；FA2104N电子分析天平（安徽东南仪诚实验室设备有限公司）；KQ2200DV型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；TGL-16G高速离心机（上海安亭科学仪器厂）；旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂）；循环水式真空泵（巩义市英峪予华仪器厂）；GZX-9070数显鼓风干燥箱、HHS型电热恒温水浴锅（上海博讯实业有限公司）。
酸枣仁药材购于武汉生达新世纪大药房（由本室鉴定），酸枣仁皂苷A标准品（纯度约为98%）购于上海锐聪科技发展有限公司。石油醚、乙醇、正丁醇、氨水等试剂均为分析纯，乙腈、甲醇为色谱纯，实验用水为蒸馏水，高效液相色谱用水为娃哈哈饮用纯净水。 2 试验方法
2.1 原料的处理与保存
酸枣仁中药材粉碎过40目筛，阴凉通风处保存。
2.2 色谱条件[5，6]
色谱柱：Luna C18反相柱（150x4.6 mm）；流動相：最初5 min为乙腈-水（20：80），5～20 min内乙腈浓度（体积分数，下同）梯度上升为70%，20～22 min乙腈浓度梯度回到20%。流速：1 mL/min；进样量：20 μl；检测波长：203 nm；柱温：25℃。梯度洗脱程序见表1
表1梯度洗脱程序
2.3 酸枣仁皂苷A含量测定[7，8]
2.3.1 对照品溶液的制备
精密称取酸枣仁皂苷A标准品20 mg，置于10 mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，得2 mg/mL的溶液备用。分别吸取备用液5 μl、25 μl、50 μl、100 μl、200 μl、300 μl、400 μl，分别用甲醇稀释至1 mL，摇匀，配制成1～7号样品。各种标准溶液酸枣仁皂苷A含量见表2。
取上表中的7个不同浓度的标准溶液按上述色谱条件分别进样20 μl，以峰面积积分值为纵坐标，酸枣仁皂苷A浓度为横坐标，绘制标准曲线，并计算回归方程Y=5487.5X-6993.4，r=0.9997。结果表明，酸枣仁皂苷A在10～800μg/mL
范围内有良好的线性关系。
A
B
图1 HPLC色谱图
A：酸枣仁皂苷A标准品B：酸枣仁提取物样品 1：酸枣仁皂苷A
Fig.1 HPLC chromatogram map
A： Standard of jujuboside A；B： Extract sample of semen ziziphi spinose； 1：Jujuboside A
2.3.2 供试品溶液的制备及分析[9]
精密称取酸枣仁粉末约5g，按一定的实验设计超声提取2次，合并提取液，旋转蒸发浓缩，得乙醇提取物。将乙醇提取物用20ml水超声溶解2次，合并提取液，用水饱和的正丁醇萃取3次，每次20ml，合并正丁醇提取液，用正丁醇饱和氨水10ml洗涤1次，洗液弃去，正丁醇提取液置旋转蒸发仪上减压蒸干，残渣用甲醇溶解，定量转移至10ml容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，备用。过0.2μm滤膜，采用HPLC测定，记录峰面积，并折算成1g酸枣仁中酸枣仁皂苷A的含量，各样品取测定结果平均值。
3 结果与讨论
3.1 单因素试验[10，11，12.13]
3.1.1乙醇浓度（体积分数，下同）对酸枣仁皂苷A提取率的影响
精密称取酸枣仁粉末约5 g各5份，提取温度50℃，液料比12：1（ml：g下同），提取时间40min，提取2次，提取功率70w，考察不同乙醇浓度对酸枣仁皂苷A提取率的影响，结果见图2。
由图2可以看出，乙醇浓度在0～95%范围内，随着乙醇浓度的升高，提取溶剂对物料的渗透能力增强，酸枣仁皂苷A的溶解度升高，但当乙醇浓度大于70%后，随着溶剂极性的降低，酸枣仁皂苷A溶解度下降，提取率降低。得知在乙醇浓度在70%附近有较高的提取率，因此乙醇浓度选70%。
3.1.2 温度对酸枣仁皂苷A提取率的影响
精密称取酸枣仁约5 g各5份，乙醇浓度70%，液料比12：1，提取时间40 min，提取2次，提取功率70w，考察提取温度对酸枣仁皂苷A提取率的影响，结果见图3。
由图3可以看出，当提取温度较低时，水溶性差的酸枣仁皂苷即使在萃取剂的作用下也难以发生相的转移而进入液相中。在相同条件下，当提取温度上升时，扩散系数增大，提取剂的渗透能力也相应增强，使所提取的有效成分浸出速率增大。但由于温度超过50℃，酸枣仁皂苷提取率变化不大，实验过程考虑到能耗问题，故选取50℃时为最佳提取温度。
3.1.3 液料比对酸枣仁皂苷A提取率的影响
精密称取酸枣仁粉末约5 g各5份，乙醇浓度70%，提取温度50℃，提取时间40 min，提取2次，提取功率70%，考察料液比对酸枣仁皂苷A提取率的影响，结果见图4。
由图4可以看出，溶剂量的增加提高了物料体系与提取剂体系间酸枣仁皂苷的质量浓度差，并减少了物料中有效成分的残余量，从而提高提取率。溶剂量超过12倍，提取率变化不明显，考虑成本问题，故液料比选取12倍。
3.1.4 时间对酸枣仁皂苷A提取率的影响
精密称取酸枣仁粉末约5 g各5份，乙醇浓度70%，提取温度50℃，液料比12：1，提取2次，提取功率70%，考察提取时间对酸枣仁皂苷A提取率影响，结果见图5。
由图5可以看出，提取时间的延长有利于有效成分的溶出，但时间过长则会引起有效成分的降解，提取率下降。故提取时间选取40 min。
3.1.5 超声功率对酸枣仁皂苷A提取率的影响
精密称取酸枣仁粉末约5 g各4份，乙醇浓度70%，提取温度50℃，液料比12：1，提取时间40 min，提取2次，考察提取功率对酸枣仁皂苷A提取率的影响，结果见图6。
由图6可以看出，超声功率从40%增大到70%时，皂苷A含量有所增高，超过70%后，含量下降。原因可能是随着超声功率的提高，加强了胞内物质的释放、扩散及溶解，从而提高了提取物的含量，随着超声功率的进一步提高，酸枣仁中的杂质溶出，从而降低了总皂苷A的含量。故超声功率选70%。 3.2 响应面分析实验[14，15，16]
综合考虑单因子试验结果，根据Box-Behnken的中心组合设计原理，选取乙醇浓度、超声温度、超声功率三个对酸枣仁皂苷A提取影响比较显著的的因素，采用三因素三水平的响应面分析方法，根据单因素试验结果选取因素水平。试验因素与水平设计见表3。实验设计与实验结果见表4，表5。
表3：Box-Benhnken实验因素及水平表
表4 响应面试验设计与试验结果
Tab.4： Experiment design and results of response surface methodology
在17个试验中， 1～12是析因试验，13～15是中心试验，用来估计试验误差，试验结果见表4。利用Design-Expert软件对表4响应值与各因素进行二次多元回归拟合后，得到回归方程：
皂苷含量=
310.35-15.72A+8.45B+12.0C+10.69AB+5.22AC+6.15BC-34.43A2-52.63B2-27.89C2
对上述回归模型进行方差分析（见表5），回归方程中各变量对指标（响应值）影响的显著性，由F检验来判定，概率P的值越小，则相应变量的显著程度越高。由表5可以看出，各因素中，显著的因素有B、C，即超声提取的温度和功率。回归模型也是高度显著的（P=0.0056）， 回归模型的决定系数为0.9134，说明该模型能够解释91.34%的变化，因此可用此模型对酸枣仁皂苷提取率进行分析和预测。
3.3 酸枣仁皂苷A提取率的响应面优化[17，18，19]
利用Design-Expert软件对表4数据进行二次多元回归拟合，所得到的二次回归方程的响应面及其等高线见图7～9。
从图7等高线图可以直观地看出，在功率为超声功率为70w时，乙醇浓度和提取温度对酸枣仁皂苷提取的交互作用不显著。因为等高线的形状反映出交互效应的强弱大小，椭圆形表示两因素交互作用显著，而圆形则与之相反[20]。乙醇浓度较低时，适当提高温度可以提高酸枣仁皂苷的提取率，由曲面图可以看出，在一定的乙醇浓度范围内，随着乙醇浓度的增大，酸枣仁皂苷的提取率增加，超过一定的乙醇浓度后，皂苷的提取率反而有所下降，这表明，在本试验水平范围内，适当提高乙醇浓度有利于皂苷的浸出，但乙醇浓度过高，溶剂极性变小，不利于酸枣仁皂苷的提取。
Fig.7 Response surface plot showing the effects of extraction ethanol concentration and ultrasonic temperature on extraction yield of jujuboside A
提取温度为50℃时，乙醇浓度和超声功率的交互作用显著（图8）。乙醇浓度60%时，要得到较高产量必须加大功率，而乙醇浓度70%时，较低的功率就能达到较高的产量。由此可见，适当增加功率，降低乙醇浓度，可提高皂苷的产量。
乙醇浓度70%时，超声温度和超声功率较显著（图9）。提取温度较低时，增大功率就能提高皂苷提取产量，功率较低时，要的到较高的提取产量必须提高温度，由此可见，适当降低温度，增大超声功率，可提高酸枣仁皂苷的提取产量。
图9 温度和功率交互作用对酸枣仁皂苷提取产量的影响
Fig.9 Response surface plot showing the effects of extraction ultrasonic temperature and ultrasonic power on extraction yield of jujuboside A
3.4 验证性试验
通过对酸枣仁皂苷提取产量的二次多项数学模型解逆矩阵，得出酸枣仁皂苷在乙醇浓度为69.8%，超声温度为44.6℃，超声功率为74.1w工艺条件下，提取的酸枣仁皂苷A含量预测值为324.719μg/g。验证性试验表明，在此条件下的提取产量比单因素组合最佳提取条件高出2.57%。
表6 试验结果的验证
4 结论
本研究用Box-Benhnken中心组合实验设计和响应面分析法对酸枣仁皂苷的提取工艺参数进行了优化，建立的二次多项数学模型具有显著性（P=0.0056），决定系数为0.9134。由模型解逆矩阵得到最佳工艺条件：在乙醇浓度为69.8%，超声温度为44.6℃，超声功率为74.1w工艺条件下，提取的酸枣仁皂苷A含量预测值为324.719 μg/g。实际提取产量为321.09 μg/g。
参考文献
[1] 海洪，汪坤，金文英，等.Box-Behnken響应面法优化超声波提取蚕沙中叶绿素的工艺研究[J]食品工业科技，2009，30（3）：207～209
[2] Annudurai G， Sheeja R Y. Use of Box-Behken design of experiments for the adsorption of verofix-red using biopolymer[J].Bioprocess Eng，1998，18：463～466
[3] 张永军，唐玉海，刘宏浪，等.酸枣仁总皂苷的提取工艺研究[J].西北药学杂志，2001， 16（ 1）：18. [4] 高聲传，郭涛，夏维杰，等.比色法测定酸枣仁提取物中总皂苷的含量[J].实用药物与临床，2005，8（1）：15～16
[5] 周庆武，李玲玲，纪标，等. RP-HPLC测定酸枣仁颗粒中酸枣仁皂苷A、B含量[J].中成药，2008，30（6）：16～17
[6] Mingchun Zhang， Yanqing Zhang， Junbo Xie. Simultaneous determination of jujuboside A， B and betulinic acid in semen Ziziphi spinosae by high performance liquid chromatography-evaporativelight scattering detection[J]. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis ， 2008，48：1467～1470
[7] 李玉娟，车振涛，毕开顺，等.反相高效液相法测定酸枣仁中酸枣仁皂苷A的含量[J].中国中药杂志，2001，26（5）309～310
[8] 房信胜，王建华，祝丽香等.微波辅助提取酸枣仁皂苷A的工艺优化[J].林产化学与工业，2010，30（1）：92～96
[9] 吴玉兰，丁安伟，包贝华.炒酸枣仁中酸枣仁皂苷的提取纯化工艺研究[J].中药材，2005，28（3）：219～223
[10] 王琪，张名位，孙远明，等.苦瓜皂苷的超声-微波协同提取工艺优化[J].广东农业科学，2009，6：120～123
[11] 李健，陈姝娟，张若男.超声辅助溶剂法提取肉桂总皂苷工艺的研究[J].食品科学，2008，29（04）：177～180
[12] 吴莉莉，孟庆艳，刘圆.红毛五加茎皮中总皂苷超声提取工艺研究[J]西南民族大学学报 自然科学版，2007，33（3）：535～537
[13]刘良坡，李爱锋，孙爱玲等.响应面分析方法优化超声提取桅子苷工艺研究[J].四川中医，2009，27（3）：46～48
[14] 雷恒，汪芳安，李永丽等.响应面法优化红曲色素的提取工艺及其稳定性研究[J].食品工业科技，2010，31（6）：283～286
[15]范龚键，韩永斌，顾振新.用响应面法优化红甘蓝色素提取工艺参数[J].南京农业大学学报，2006，29（1）：103～107
[16]邓洁红，谭兴和，郭时印等.响应面法优化刺葡萄皮色素提取工艺参数[J].湖南农业大学学报（自然科学版）.2007.33（6）：694～699
[17]海洪，汪坤，金文英等.Box-Behnken响应面法优化超声波提取蚕沙中叶绿素的工艺研究[J].食品工业科技，2009，30（3）：207～209
[18]王世磊. Design-Expert软件在响应面优化法中的应用.郑州大学
[19]赵鹏，李稳宏，李东等.响应面法优化金银花多糖超声提取工艺研究[J].食品科学，2009，30（20）：151～154
[20] Muralidhar R V， Chirumamila R R， Marchant R. et al.A response surface approach for the comparison of lipase production by Candida cylindracea using two different carbon sources[J].Biochem Eng J， 2001，9： 17～23.