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嗜盐耐盐真菌是一类能够在高盐环境下生长或者需要高盐环境才能生长的极端环境真核微生物。由于嗜盐耐盐真菌生长环境较特别,在长期的进化和适应过程可能促使其具有不同于普通微生物的细胞特征,其产生的代谢产物等也可能具有独特的性质。近年来,研究者一方面尝试着从海水或者其他高盐环境中分离新的嗜盐耐盐真菌,另一方面也期望从其代谢产物中寻找特殊的有机物或开发这些极端真菌的经济价值。木质纤维素是自然界储量最丰富的多糖,也是一种可再生资源,而纤维素酶能够降解这些多糖。随着石油等不可再生资源的减少和环保形势的严峻,运用纤维素酶降解木质纤维素发酵生产生物乙醇燃料对于缓解能源危机具有重要意义,也成为了近年来研究的热点。纤维素结晶区难以降解,而纤维二糖酶能作用该区域,促进纤维素崩解。因此,挖掘和研究微生物中的纤维二糖酶基因,能促使人们进一步理解纤维素酶作用机制和开发其应用价值。本研究从干海鱼上筛选到一株嗜盐真菌MF1,从形态学、部分生理生化和多基因系统发育学对该分离菌株进行了鉴定。由于该菌株能在高浓度盐环境下产生纤维素酶,因此进一步对其外切葡聚糖酶基因进行了克隆与异源表达。本研究主要有以下内容和结论:1、嗜盐真菌MF1的鉴定。利用含10%的NaCl的查氏琼脂培养基从低温保存(4℃)干海鱼上筛选到一株真菌,通过对分离菌株和购买的标准菌株Phialosimplex salinarum DSM27530的不同培养基特征、显微形态特征、耐盐性和15%NaCl的条件下的碳源利用能力的检测分析,发现分离菌株MF1生长NaCl范围为0%~33%,最适生长NaCl浓度为15%,并能够在15%NaCl的条件下利用淀粉、橄榄油、木质素、蛋白或纤维素为单一碳源生长。随后,对分离菌株的8个位点基因:18S rDNA、ITS、核糖体生物合成蛋白(Tsr1)、钙调蛋白基因(CaM)、β-微管蛋白基因(BenA)、分子伴侣蛋白复合物TCP-1(Cct8)、RNA聚合酶Ⅰ基因(PBR1)和RNA聚合酶II基因(PBR2)的序列进行克隆与测序。最后进行多基因联合系统发育分析,将MF1鉴定为Phialosimplex halophila的一个菌株,命名为Phialosimplex halophila–MF1。2、嗜盐真菌Phialosimplex halophila-MF1的外切葡聚糖酶cbhII基因的克隆。由于分离菌株能在含15%的NaCl平板利用纤维素为唯一碳源生长,说明该菌株能在高盐环境下产生纤维素酶酶系。因此,我们尝试进一步从分离菌株Phialosimplex halophila–MF1克隆外切纤维素酶基因cbh II。首先,下载CBHII氨基酸序列,根据保守区及密码子偏好性设计简并引物,PCR扩增得到保守区序列;随后运用染色体步移法扩增得到包含外切纤维酶基因全长的核苷酸序列;并运用生物信息学方法分析基因的起始密码子和终止密码子信息,设计cbh全长的引物,进行反转录PCR最终得到cbhII基因。其CBHII序列与GenBank中序列一致性最高的仅70%,因此该cbhⅡ基因具有一定的新颖性。对来源于菌株MF1的cbhII基因进行了生物信息分析,建立了CBHII的三维空间结构模型。3、外切葡聚糖酶(cbh II)基因转化毕赤酵母菌株及其分泌表达。将成熟蛋白的cbhⅡ基因片段与pPIC9k载体连接,测序正确的载体经Bgl II处理后电转化毕赤酵母菌株;随后,通过平板筛选和PCR扩增确认cbhII基因转入该菌株,选取酶活相对较高的重组菌株进行摇瓶发酵实验。重组毕赤酵母用0.5%甲醇诱导,定期取发酵液利用DNS法测定其酶活性并进行SDS-PAGE检测,发现第6天重组酶活性最高。将发酵粗酶液经镍柱纯化后,分别测定了该纯酶性质。结果为:获得了一株产外切葡聚糖酶活力为1.27 U/L的重组毕赤酵母菌株。将重组酶进行纯化后研究了其部分酶学性质:纯化重组酶相对活力为0.44 U/mg;重组酶在50℃酶活力最高,而在20~50℃,该重组酶相对活力超过80%,说明重组酶能在较低温度下还能发挥一定活性。本研究是首次关于来源于Phialosimplex分类单元中嗜盐真菌的功能基因克隆和异源表达的报道。