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研究背景冬病夏治是中医药防治疾病的特色疗法,体现“天人相应”的整体观、“春夏养阳,秋冬养阴”的阴阳平衡观,冬病夏治穴位贴敷疗法被应用于多种疾病的防治,尤其对肺部疾病的防治具有良好的疗效。支气管哮喘是一种支气管慢性炎症性疾病,是全球最常见的慢性疾病之一,其日益增长的发病率与死亡率受到了广泛的关注。“冬病夏治”方穴位贴敷疗法治疗哮喘,其临床效果良好副作用小等特点使其已成为我国临床中哮喘治疗广泛应用的特色疗法,但其作用机制至今仍未被阐明,难以从整体层面阐述其作用机理,而代谢组学及菌群组学分析技术从整体上展示生物体内的动态变化状况,避免了以往采用单一或局部几个指标作为研究其病理生理变化的弊端,从多角度和整体性出发,为哮喘治疗机制的研究提供了新颖的切入点。研究目的本研究旨在探讨“冬病夏治”方穴位贴敷治疗哮喘的作用机制。1.研究处方对哮喘豚鼠肠道菌群丰度及结构的影响,筛选出与哮喘相关的菌群水平生物标志物。2.探讨处方对哮喘豚鼠内源性物质代谢的影响,筛选出哮喘发病及治疗相关的内源性小分子生物标志物。3.研究处方对哮喘豚鼠炎症相关蛋白表达的影响,阐明处方的抗炎机制。4.探讨处方中成分白芥子挥发油对方中多个标志性成分的透皮吸收影响,阐明处方中白芥子的经皮促透作用。5.通过探讨白芥子挥发油对皮肤屏障的影响,阐述其经皮促渗透的机制,阐明白芥子“发泡”原理及其在“冬病夏治”疗法中的意义。研究方法1.将豚鼠随机分成空白组、哮喘模型组(OVA)、阳性对照组(DSP)、”冬病夏治”方治疗组(AST),使用OVA致敏建立豚鼠哮喘模型。通过HE和Masson染色对豚鼠肺组织进行病理学评估。2.提取豚鼠粪便总基因组DNA,对16S rDNA V4可变区基因进行PCR扩增及IlluminaHiseq测序,并进行生物信息学分析,探究处方对哮喘豚鼠肠道菌群多样性及菌群结构的影响。3.采用UPLC-ESI-QTOF-MS对各组豚鼠血清中内源性物质进行检测,利用主成分分析法(PCA)等分析方法进行数据统计分析,比较各组血清代谢组学原始图谱与数据。4.采用分子生物学技术检测豚鼠体内中Th2细胞因子和IgE水平,以及NF-kB信号通路相关蛋白浓度。5.采用体外透皮试验,HPLC法测定各模型药物透过量,评价白芥子挥发油对处方中的多个标志性成分经皮渗透影响。6.透射电镜(TEM)及傅里叶红外光谱(FTIR)评价白芥子挥发油对角质层结构的影响,研究白芥子挥发油对角质层结构,采用HaCaT细胞作为皮肤屏障体外研究模型,考察白芥子挥发油对活性表皮细胞生理生化功能相关指标的作用,通过其对皮肤屏障的作用研究其促透机制。研究结果1.使用“冬病夏治”方穴位贴敷对卵清蛋白(OVA)诱导的豚鼠过敏性哮喘具有显著的缓解作用。该疗法减轻了豚鼠气道和肺部炎症及胶原沉积情况。2.“冬病夏治”方穴位贴敷给药后哮喘豚鼠的肠道菌群多样性升高,但无显著性差异。空白组中普雷沃氏菌科(Prevotllaaceae)、普氏菌属(Prevotella)、厚壁菌门(Fimicutes)、Succinogenes菌、节杆菌属(Arthrobacter)、微球菌科(Micrococcaceae)的菌群丰富度较高,哮喘模型组中Flexispira菌丰富度较高,阳性对照组中Flavefaciens菌的菌群丰富度较高,经“冬病夏治”方治疗后,豚鼠肠道中弯曲杆菌(Camppylobacter)、Rhizosphaera 菌、梭菌科(Clostridiiaceae)、放线菌门(Actinobacteria)、梭菌属(Clostrtdium)、双歧杆菌属(Bifidobacterium)、Parabacteroides 菌、双歧杆菌目(Bifidobacteriales)、双歧杆菌科(Bifidobacteriaceae)、食单胞菌(Stenotrophomonas)、乳杆菌科(Lactobacillaceae)、乳杆菌属(Lactoacillus)、DiLtasonis 菌、红蝽菌目(Coriobbaacteriales)、红蝽菌科((Coriobacteraceae)、布劳特氏菌属(Blautia)、红蝽菌纲(Coriobactertiia)、黄单胞菌科(Xanthomonadaceae)、黄单胞菌目(Xanthomonadales)的菌群丰富度较高。3.代谢组学结果表明,豚鼠哮喘发病后磷脂、鞘脂、嘌呤、氨基酸和肾上腺素的代谢水平异常,经过该疗法治疗后向正常水平恢复。ORMDL3检测结果表明,该方通过下调ORMDL3的表达来抑制鞘脂代谢。4.该疗法治疗后降低了豚鼠肺组织及血清中IL-4,IL-5,IL-13的表达水平和IgE含量,抑制了 p65磷酸化和IKB的降解及磷酸化。5.白芥子挥发油可显著促进处方中标志性成分经皮渗透吸收,且呈浓度依赖性,即浓度越大,促透效果越好。6.白芥子挥发油可改变皮肤角质层结构及脂质含量,增加HaCaT细胞内的Ca2+浓度、降低细胞内Ca2+--ATP酶活性、降低细胞膜电位。结论1.“冬病夏治”方穴位贴敷能有效治疗哮喘,减轻肺部炎症,改善哮喘症状。2.该方调控肠道菌群结构,提高有益菌的菌群丰度,抑制Th2反应,降低了血清中IL-4,IL-5,IL-13和IgE的水平,使Th1/Th2趋于平衡,通过抑制p65磷酸化和IkB的降解及磷酸化进行抗炎,达到治疗哮喘的效果。3.该方能有效调控豚鼠体内哮喘相关内源性小分子的代谢,筛选出26个与哮喘相关的生物标志物。4.白芥子挥发油能促进处方中标志性成分经皮渗透吸收,作为处方中主要药物起到了治疗与促进药物渗透双重作用,从而达到增效的目的。5.白芥子挥发油可通过改变皮肤角质层结构及脂质含量,改变角质形成细胞生理生化相关功能,降低皮肤表皮层的的屏障作用,促进药物的透皮吸收,也为经皮促透剂作用机制的研究提供新的思路和方法。