猪流行性腹泻(porcine epidemic diarrhea,PED)是由猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)引起的一种急性、高度接触性肠道传染病,主要特征表现为急性肠炎、呕吐、腹泻和脱水,各年龄阶段的猪均易感,初生仔猪最为严重,发病率和死亡率极高,给养猪业造成了巨大的经济损失。酵母双杂交系统是目前研究蛋白质间相互作用的一种有效技术,该系统灵敏性高,能检测到生物体内很弱的蛋白质相互作用。本研究主要利用酵母双杂交系统探究PEDV各病毒蛋白间存在的相互作用以及分别筛选与PEDV nsp14、nsp16存在相互作用的宿主蛋白。主要研究内容如下:1.酵母双杂交实验分析PEDV各蛋白间的相互作用首先,构建PEDV除nsp11外所有病毒蛋白的两套酵母融合表达质粒,包括诱饵蛋白质粒p GBKT7-X(bait)和猎物蛋白质粒p GADT7-X(prey)共44个,对其进行自激活活性和毒性检测,发现p GBKT7-nsp15、p GADT7-nsp4、p GADT7-nsp5、p GADT7-nsp15对酵母Y2H菌株有一定毒性,p GBKT7-nsp3-1有自激活活性(不能用于酵母双杂交实验)。然后,将所有bait和prey质粒以点对点的方式两两共转化酵母Y2H菌株以检测PEDV各蛋白间存在的相互作用,通过酵母双杂交实验共筛选了462组互作,结果筛选到46组存在相互作用,包括29组单向互作,12组双向互作及5组自身互作。2.猪小肠上皮细胞酵母双杂交c DNA文库的构建及鉴定首先在体外培养猪小肠上皮细胞并提取其总RNA,以总RNA为模板合成含有与p GADT7-Rec线性载体同源末端的ds-c DNA,然后将ds-c DNA与p GADT7-Rec共转入酵母Y187菌株中,通过同源重组获得酵母双杂交c DNA文库,最后将所有克隆收集并分装成1ml文库用于双杂交筛选。本实验成功构建并鉴定了一个较高质量的猪小肠上皮细胞酵母双杂交c DNA文库,文库滴度6.5×108 cfu/m L,文库容量1.04×1011cfu。3.筛选c DNA文库以获得与PEDV nsp14、nsp16相互作用的宿主蛋白将诱饵蛋白质粒p GBKT7-nsp14和p GBKT7-nsp16分别转化Y2H菌株,转化产物分别与1m L猪小肠上皮细胞酵母双杂交c DNA文库共培养,通过对文库的筛选分析得到nsp14和nsp16的潜在互作宿主蛋白。通过酵母回复杂交实验发现nsp14与宿主蛋白CCT7、EIF3I存在相互作用,nsp16与宿主蛋白DDIT4、UBE2K、UBA52存在相互作用。通过免疫共沉淀实验进一步发现,在HEK293T细胞中nsp16与宿主蛋白DDIT4、UBE2K存在相互作用,nsp14与所检测宿主蛋白没有相互作用。通过共定位实验发现nsp16与DDIT4、nsp16与UBE2K均共定位于细胞质。