【摘要】 目的 观察米诺环素对佐剂性关节炎的治疗作用及对血清细胞因子的影响。方法 大鼠右踝外侧皮下注射弗氏完全佐剂（CFA）制备佐剂性关节炎模型，在注射CFA前30 min 腹腔注射米诺环素50mg.kg-1，以后每天同一时间给药，连续8天。观察踝关节肿胀程度和关节疼痛评分。在CFA注射后第3天，利用ELISA的方法测定血清细胞因子IL-1β、IL-6、TNF-α的水平。结果 腹腔注射米诺环素明显减轻注射侧关节肿胀程度，减轻关节疼痛试验评分，明显降低血清IL-1β、IL-6、TNF-α水平。结论 腹腔注射米诺环素可减轻佐剂性关节炎大鼠关节肿胀和疼痛；该作用可能与降低前炎性細胞因子水平有关。
　　 【关键词】 米诺环素；佐剂性关节炎；细胞因子
　　 类风湿关节炎作为一种自身免疫性疾病，以关节的疼痛肿胀和功能障碍为主要特征，严重影响患者的身体健康和生活质量。细胞因子在RA的发生、炎症的迁延、关节的破坏中占有重要的地位［1］。米诺环素是一种半合成四环素衍生物，主要用于感染和外周炎症的治疗，对关节炎作用的研究不多。本实验通过制作佐剂性关节炎模型，观察腹腔注射米诺环素对佐剂性关节炎的治疗作用和血清促炎性细胞因子的变化，探讨米诺环素治疗关节炎的可能机制。
　　1 材料和方法
　　1.1 试验动物 雄性健康 SD 大鼠，体重180～200 g。由苏州大学医学院实验动物中心提供。所有动物均单笼饲养1周后进行实验，室温保持在 (23±3)℃，光照和无光照时间12 h 周期交替，可自由进食和饮水。
　　1.2 主要药品、试剂和仪器 米诺环素、完全氟氏佐剂(CFA)（Sigma）；Rat IL-1β、Rat IL-6 、Rat TNF-α 试剂盒（美国R&D公司进口分装）；酶标仪（芬兰）；洗板机（美国）；低温离心机（苏州）；低温冰箱（日本）；游标卡尺：上海测绘仪器厂。
　　1.3 关节炎模型的制备 在大鼠的右踝关节外侧皮下注射（s.c.）50 μl CFA，制作单发性佐剂性关节炎模型。
　　1.4 实验分组
　　1.4.1 足部肿胀和跖、背屈踝关节疼痛试验的观察 16只大鼠随机分为二组：生理盐水组（C）,米诺环素组（M），每组8只。二组分别在右踝部s.c. CFA前30 min 腹腔分别注射等容积的生理盐水、米诺环素（50mg.kg-1）, 每24h一次，连续8天。每天给药后30 min测量内外踝的厚度，连续12天。
　　1.4.2 细胞因子的研究 18只大鼠随机分为三组：正常对照组（N）,生理盐水组（C）,米诺环素组（M）,每组6只。N组不做任何处理，C 组、M 组在右踝部s.c. CFA前30 min 腹腔分别注射等容积的生理盐水、米诺环素（50mg.kg-1）, 每24h一次，连续3天。
　　1.5 观察指标
　　1.5.1 踝关节肿胀程度 使用游标卡尺测量双侧后肢内外踝关节最宽宽度，每侧测量2次再求各次测量均值，持续测量12天。采用注射后内外踝的厚度／注射前内外踝的厚度表示肿胀程度。
　　1.5.2 跖、背屈踝关节疼痛试验评分 评分方法:参照刘红香等［2］的评分方法，向脚掌侧缓慢屈曲(跖屈)动物的一侧踝关节，每隔 5s 进行一次，共5次。跖屈关节时动物若出现嘶叫或短促而明显的缩腿反应则评分为1，无反应评分为0。每侧踝关节每种指标的评分为0～5,两种指标的总评分为0～10，记录其嘶叫和缩腿的总评分。将踝关节向足背侧弯曲(背屈)，可测得背屈关节疼痛试验评分，评分方法与跖屈关节评分方法相同。
　　1.5.3 细胞因子的测量 在第三天腹腔给药后 30 min ，腹腔注射戊巴比妥钠（50mg.kg-1）深麻醉下左心室取血，离心后取血清-80℃保存，标本收齐后用ELISA法检测血清细胞因子的含量，具体方法严格按照说明书要求。
　　1.6 统计学处理 所有数据均以均数±标准差（x±s）表示，组内比较用t检验，组间比较用单因素方差分析，以SAS统计软件分析，p<0.05 为差异有显著性。
　　2 结果
　　2.1 CFA皮下注射1 h起可看到患肢跛行、肿胀，着地时间缩短。注射后1～4天注射侧踝关节红肿明显，9天后明显恢复。腹腔注射米诺环素踝关节肿胀程度明显减轻（表1）。在观察期间，左侧踝关节无明显异常变化。
　　2.2 CFA皮下注射后1～4天注射侧踝关节跖屈评分较高，随后逐渐下降，腹腔注射米诺环素明显降低跖屈评分，第9天后关节疼痛评分无明显变化（表2）。背曲有相似的变化（表3）。在观察期间左侧踝关节疼痛评分无明显变化。
　　2.3 生理盐水组和米诺环素组血清IL-1β、IL-6、TNF-α水平明显比正常对照组高，米诺环素组这些炎性细胞因子的表达水平明显比生理盐水组低（表4）。
　　3 讨论
　　 CFA注射到踝关节皮下可产生一个单发性关节炎性模型，这个模型死亡率低，全身反应小，大鼠体重减轻少，但保留了类风湿性关节炎的特点［3］。产生的关节炎症状比经典的多发性关节炎轻，可观察10～14天。
　　 实验中发现，CFA皮下注射产生明显的踝关节肿胀，米诺环素能减轻CFA诱导的外周水肿，可能机制：CFA诱导外周免疫细胞激活，米诺环素也许抑制免疫细胞的激活，Ingham 等[4]研究发现米诺环素对白细胞趋化性有显著的抑制作用，这样减少炎性细胞因子的释放。CFA能诱导明显的关节疼痛，腹腔注射米诺环素能明显减轻关节疼痛评分。其机制可能与减轻局部水肿和炎症有关。
　　 细胞因子是RA炎症和损伤的重要介质，其中IL-lβ、IL-6、TNF-α在RA疾病的研究中备受关注［5,6］。IL-lβ、IL-6、TNF-α是促炎性细胞因子，在佐剂性关节炎，局部的促炎性细胞因子是明显增高的［7］，我们的实验发现血液中的这些前炎性细胞因子也是增高的。IL-lβ主要由活化的单核／巨噬细胞产生，具有广泛的生物学效应，在免疫应答及炎症反应中起重要作用。TNF-α主要来自单核／巨噬细胞以及T淋巴细胞，是强有力的促炎症反应的细胞因子。TNF-α可以通过激活内皮细胞、促进炎性因子合成和释放等多种途径参与RA的发病和进展。IL-6可由活化的淋巴细胞、单核细胞和纤维母细胞产生，IL-1和TNF-α都能诱导IL-6的合成和分泌。在RA中，IL-6不能直接刺激滑膜母细胞和软骨细胞产生PGE2和胶原酶， 而是增强了IL-1和TNF-α的效应 [6]。
　　 本实验研究表明米诺环素可以减轻关节炎大鼠关节肿胀和疼痛，降低血清IL-lβ、IL-6、TNF-α水平，是治疗关节炎的可选择药物。
　　
　　参考文献
　　［1］Arend WP, Dayer JM. Cytokines and cytokine inhibitors or antagonists in rheumatoid arthritis[J]. Arthritis Rheum, 1990, 33(3): 305-315．
　　［2］刘红香，熊亮，罗非, 等.大鼠踝关节疼痛试验评分指标的改进[J]. 中国疼痛医学杂志, 1998, 4(3): 173-178
　　［3］Donaldson LF, Seckl JR, McQueen DS. A discrete adjuvant-induced monoarthritis in the rat: effects of adjuvant dose[J]. J Neurosci Methods 1993, 49(1-2): 5-10.
　　［4］ Ingham E，Turnbull L，Kearney JN．The effects of minocycline and tetraycline on the mitotic response of human peripheral blood lymphocytes．J Antimicrob Chemother, 1991, 27(5):607-617．
　　［5］ Kannan K, Ortmann RA, Kimpel D．Animal models of rheumatoid arthritis and their relevance to human disease[J]. Pathophysiology, 2005, 12(3): 167-l81．
　　［6］ Nakahara H, Song J, Sugimoto M, et al. Anti-interleukin-6 receptor antibody therapy reduces vascular endothelial growth factor production in rheumatoid arthritis[J]. Arthritis Rheum, 2003, 48(6): 1521-1529
　　［7］Harris ED Jr. Rheumatoid arthritis. Pathophysiology and implications for therapy[J]. N Engl J Med, 1990, 322(18): 1277－1289.