研究背景与目的:结直肠癌（Colorectal cancer,CRC）在所有肿瘤当中发病率高,死亡率高,虽然骨转移在与其他部位转移相比发生率较低,但其预后极差。并且一旦发生骨转移,全身骨骼多为散在转移灶,无法进行手术治疗。伴有骨转移的CRC患者的年生存率仅为30%。因为目前骨转移常见肿瘤多为乳腺癌、肺癌、前列腺癌,由于CRC骨转移发病率相对较低,所以目前文献关于CRC骨转移的研究较少,关于其发病机制及转移特点几乎没有,但随着医疗技术的进步,各种靶向药物及放射治疗提高了CRC患者的生存期,故CRC骨转移的患者越来越多,所以现在对其发病机制及转移方式的研究就显得尤为重要。CRC骨转移的典型临床表现为骨质的破坏,骨质破坏的严重不良后果为病理性骨折,从而影响患者的生存质量。骨质的破坏可以间接反应CRC患者疾病的进展。与其他溶骨性肿瘤一样,CRC骨转移导致的骨质破坏与破骨细胞（Osteoclast,OC）紧密相关。OC来源于早期的破骨前体细胞（Osteoclast precursors,OCPs）,而OCPs来源于单核巨噬细胞,所以OC、OCPs、单核巨噬细胞在CRC骨转移中起着重要作用。目前在乳腺癌、肺癌和前列腺癌等肿瘤骨转移中,关于OC参与骨转移调控机制已经做了充分的研究,但由于每种肿瘤与肿瘤微环境中各种细胞及因子作用机制各不相同,所以OC在CRC微环境中是如何参与骨转移,目前调控的过程尚不清楚。CC趋化因子配体7（Chemokine（C-C motif）ligand 7,CCL7）,它主要由单核细胞、血小板、成纤维细胞、上皮细胞和一些肿瘤细胞表达和分泌。通过与趋化因子受体结合发挥作用,CCL7作用的靶细胞主要包括单核细胞、树突状细胞、淋巴细胞和粒细胞。CCL7通过与其受体结合参与抗炎反应,免疫反应。CCL7的异常表达也与某些疾病的发生与发展相关。大量的研究显示,CCL7在肿瘤微环境中对于肿瘤的进展起着重要作用,促进肿瘤生长、侵袭及转移。但是,关于CCL7在CRC中的表达的研究较少,CCL7在CRC骨转移中的机制目前还未见文献报道,所以本文主要探究趋化因子在CRC骨转移过程中起着怎样的作用,从而试图为CRC骨转移找到新的治疗靶点,提高骨转移患者的生存期及生活质量。方法1.培养MC-38肿瘤细胞（小鼠结直肠癌细胞系）,用注射器向C57BL/6小鼠胫骨骨髓腔中注射MC-38细胞,从而构建小鼠结肠癌骨转移模型,运用酶联免疫吸附试验（Enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA）法检测CRC骨转移模型小鼠第10天胫骨骨髓中各种趋化因子（CCL2、CCL6、CCL7、CCL8、CCL4、CCL12、CCL5）的浓度。再运用ELISA法检测CRC骨转移模型小鼠各个时间点胫骨骨髓中CCL7的浓度变化情况。向肿瘤骨转移模型局部注射CCL7中和抗体,取不同时间点的转移部位样本制备石蜡切片,抗酒石酸酸性磷酸酶染色（Tartrated Resistant Acid Phosphates,TRAP）染色检测破骨细胞数量及比例,番红固绿染色（Safranin O-Fast green,So-f）分析实验组与对照组骨小梁变化情况。2.构建小鼠CRC骨转移模型,并局部注射CCL7抗体,通过流式分析检测不同时间点骨转移部位OCPs数量比例变化情况。进一步通过FACS分选小鼠原代OCPs,并与肿瘤条件培养基（Condition Medium,CM）进行体外共同培养,运用细胞增殖检测（Bromodeoxyuridine,BRDU）CCL7对OCPs增殖的影响,运用细胞凋亡检测（Annexin-V/PI）CCL7对OCPs凋亡的影响,运用细胞迁移实验（Transwell）及吸光度测定检测CCL7对OCPs迁移的影响,采用核因子κB受体活化因子配体（Receptor Activator of Nuclear Factor-κB Ligand,RANKL）和巨噬细胞集落刺激因子（Macrophage-stimulating factor,M-CSF）共同诱导OCPs向OC分化,诱导期间用CCL7进行干预,诱导结束后使用TRAP染色检测破骨细胞分化情况。3.构建小鼠CRC骨转移模型,取时间点骨转移部位进行流式细胞分选,检测单核细胞、骨髓间充质干细胞、MC-38细胞、中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、T细胞中CCL7m RNA的表达量。4.构建小鼠CRC骨转移模型,运用Real-time PCR检测肿瘤转移模型各个时间点CCL7m RNA的表达量。然后通过FACS分选小鼠原代OCPs,并与MC-38 CM进行体外共同培养,运用Real-time PCR检测CCL2、CCL6、CCL7m RNA的表达量。将小鼠CRC骨转移模型予以CCL7n Ab处理,提取原代OCPs,运用Transwell实验及吸光度测定检测OCPs迁移情况。5.体外提取小鼠原代OCPs,并与MC-38 CM进行体外共同培养,用c-Fos si RNA和c-Jun si RNA分别处理后,运用Real-time PCR检测CCL7m RNA的表达量。然后再用乳酸（Lactic Acid,LA）处理,进一步通过Western blot检测c-Jun、p-JNK、t-JNK、p-P38、t-P38蛋白表达水平。最后使用JNK拮抗剂、P38拮抗剂后,再次通过Western blot检测c-Jun的蛋白表达水平。6.文献显示CCR1、CCR2、CCR3是CCL7主要受体,我们体外提取小鼠原代OCPs,与MC-38CM进行体外共同培养,运用Real-time PCR检测CCR1、CCR2、CCR3 m RNA的表达量,并运用Western blot进一步检测CCR1的蛋白表达水平,体外转染si CCR1后,运用Transwell实验及吸光度测定检测OCPs迁移情况。体内转染si CCR1后,取时间点的转移部位样本制备石蜡切片,TRAP染色检测OC数量及比例,番红固绿染色分析实验组与对照组骨小梁变化情况。最后将小鼠原代OCPs用MC-38CM刺激后,使用ERK拮抗剂与P38拮抗剂处理后,运用Western blot检测下游CCR1的蛋白表达水平。结果1.CCL7在MC-38骨转移微环境中高表达,并且可以影响OCPs数量变化,抑制CCL7可缓解MC-38骨转移中的骨溶解。2.通过对MC-38骨转移过程中各种细胞中CCL7 m RNA表达量检测,我们可以发现OCPs是CCL7的主要来源。然而CCL7增加OCPs数量主要是通过促进OCPs的迁移。而对OCPs增殖、凋亡、分化影响不明显。3.阻断CCL7可抑制MC-38骨转移部位早期OCPs的招募。4.在CRC骨转移微环境中,MC38细胞产生的乳酸通过JNK通路调控c-Jun的表达,从而进一步调节OCPs分泌CCL7。5.CCR1可能是CRC骨转移微环境中参与CCL7介导的OCPs迁移的主要受体,并且ERK通路和p38 MAPK通路都可以调节OCPs中CCR1的表达,体内外实验表明下调CCR1可显著抑制CCL7介导的CRC骨转移过程中OCPs的迁移。结论在本研究中,我们发现了CCL7是CRC骨转移过程中以自分泌方式招募早期OCPs的重要调节因子。CCL7主要通过受体CCR1促进早期OCPs的迁移。有趣的是乳酸可通过激活JNK通路,刺激OCPs早期CCL7的上调。靶向抑制CCL7或CCR1可以显著缓解CRC局部骨转移引起的骨吸收。