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结核病是是涉及范围极广、危害性巨大的传染病，主要由结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis，Mtb）引起。准确、快速、高效、经济的诊断方法是控制其流行与蔓延的重要基础。 虽然细菌学检查仍是检测的金标准，但其显著性缺陷在于其检出率极低，而且需要很长的周期才能培养出菌株，又十分不便，对培养菌株的实验室必须满足生物安全措施特定的严格要求；临床上引进的一些新型诊断方法，如结核病抗体胶体金检测、γ-干扰素体外释放试验等，基本都无法对 BCG及感染者进行鉴别诊断，或是只对细胞免疫或体液免疫阶段的感染有效。另一方面，肺外结核病的临床诊断都存在有较大的难度，其病变部位分散，各个病灶所分布的结核分枝杆菌的不易被检测出来，故只能根据治疗效果、多年积累的临床经验以及穿刺取样检测等多种辅助检查，进行综合分析从而协助诊断。 因此，结核病、肺外结核病诊断标志的筛选，是对开发结核病及肺外结核病高效检测方法提出的具体需求。 RD区，即差异区域，存在于结核分枝杆菌中，但是却在其他重要菌株比如卡介苗和环境分枝杆菌、非致病性分枝杆菌中不存在，在上述两大类菌株中的存在与否差异决定了其可能作为鉴别诊断的重要标识的巨大潜力。不同菌株之间的差异区域所分别编码的蛋白因此差异在疫苗开发和诊断方面都吸引了很多的眼球。其中，位于RD1区的CFP-10等典型的特异性抗原因为具有极佳的免疫原性近些年成为结核病研究热点，极大地显示出其对于诊断与防治的重要意义。为了在此基础上提升某些RD区蛋白的血清学诊断灵敏性，本研究在结核全基因组 H37 Rv中筛选的基础上希望评估和选出具有特别诊断意义的蛋白作为特异性抗原，并将其中具有较强免疫原性的 Rv0222， Rv1509和 Rv2657 c进行克隆表达，并与现有 CFP-10， ESAT-6等蛋白进行融合，建立筛选的特异性抗原基于临床血清间接样本抗体检测的ELISA方法，并进行小样本的初步的临床应用和效果评价。 本研究主要包括以下几个方面： 1. 构建了两个融合蛋白的原核表达载体并对四个蛋白重组进行了表达及纯化 以H37 Rv为模板，克隆了结核分枝杆菌 RD4区基因的 Rv0222并与 CE基因进行融合，构建了原核表达载体pET-32a-Rv0222-CE和pET-28a-Rv0222-1509-2657c，诱导表达目的抗原基因及分别用不同的可溶性蛋白和包涵体蛋白方法纯化上述四种蛋白，得到了较纯的重组蛋白，其中 Rv0222-1509-2657 c蛋白以包涵体形式存在，其他三种均为可溶性蛋白。 2. 建立了四种用于结核病检测的ELISA抗体检测方法CE-ELISA、Rv0222-ELISA、CE-Rv0222-ELISA、Rv0222-1509-2657c-ELISA 分别建立了基于Rv0222、CE、Rv0222-CE、Rv02221509-2657c的 ELISA 抗体检测法，确定了相应的特异性抗原的ELISA包被浓度分别为1000ng/mL，1000ng/mL， 1000ng/mL，2000ng/mL，血清均1:100倍稀释。通过ROC判定各方法的OD630临界值分别为0.3971，1.0076，0.4187，0.6789。 3. 基于四种抗原CE、Rv0222、CE-Rv0222、Rv0222-1509-2657c的结核病抗体ELISA检测的准确性评估 利用背景清晰的结核病人阳性及阴性血样对 Rv0222、 CE、 Rv0222- CE、Rv02221509-2657 c所建立的四种 ELISA方法进行了准确性评估，从结果可以显示，所建立的 CE- ELISA的抗体检测方法诊断结核病的敏感性为80%，特异性为75%（其中95%CI：0.7602~0.9304）；Rv0222-ELISA的敏感性为65%，特异性为70%（其中95% CI： 0.6084~0.8341）； Rv0222-CE-ELISA法的敏感性为68%，特异性为78%（其中95%CI： 0.6554~0.8671）； Rv0222-1509-2657c-ELISA的敏感性为80%，特异性为70%（其中95%CI： 0.6536~0.8696）。 对CE与Rv0222，CE与Rv0222-1509-2657c两组蛋白分别应用于―鸡尾酒‖试验，，准确性检测结果表明前者敏感性为 85%，特异性为 40%（其中 95% CI：0.4343， 0.6932），后者所形成的“鸡尾酒”组合敏感性为 80%，相应的特异性为 45%（其中95%CI：0.4375，0.6962）。 以上结果表明CE、Rv0222、Rv0222-CE、Rv0222-1509-2657c对于结核病有一定的诊断价值，其中CE-ELISA准确性最高。 4. CE-ELISA、Rv0222-ELISA、CE-Rv0222-ELISA、Rv0222-1509-2657c-ELISA四种抗体检测方法对肺结核的诊断 利用背景清晰的肺结核及健康人血样对 Rv0222、 CE、 Rv0222- CE、Rv02221509-2657 c所建立的四种 ELISA方法进行了准确性评估，从结果可以显示，所建立的 CE- ELISA的抗体检测方法诊断结核病的敏感性为79%，特异性为65%（其中95%CI：0.7219~0.9495）；Rv0222-ELISA的敏感性为54%，特异性为88%（其中95% CI： 0.5475~0.8795）； Rv0222-CE-ELISA法的敏感性为64%，特异性为73%（其中95%CI： 0.6001~0.9142）； Rv0222-1509-2657c-ELISA的敏感性为86%，特异性为65%（其中95%CI： 0.6673~0.9362）。 表明CE、Rv0222、Rv0222-CE、Rv0222-1509-2657c对于肺结核有一定的诊断价值，其中Rv0222-1509-2657c-ELISA-ELISA准确性最高，能较好地排除肺结核。5. CE-ELISA、Rv0222-ELISA、CE-Rv0222-ELISA、Rv0222-1509-2657c-ELISA四种抗体检测方法对肺外结核的诊断 利用背景清晰的肺外结核及健康人血样对 Rv0222、 CE、 Rv0222- CE、Rv02221509-2657 c所建立的四种 ELISA方法进行了准确性评估，从结果可以显示，所建立的 CE-ELISA的抗体检测方法诊断肺外结核的敏感性为77%，对应的诊断特异性为73%（其中95%CI： 0.7108~0.9680）； Rv0222-ELISA的敏感性为57%，特异性为85%（其中95% CI： 0.5336~0.9057）； Rv0222-CE-ELISA法的敏感性为 71%，对应的诊断特异性为 80%（其中 95% CI： 0.6615~0.9421 ）；Rv0222-1509-2657c-ELISA的敏感性为93%，对应的诊断特异性为70%（其中95%CI： 0.6891~0.9645）。 表明CE、Rv0222、Rv0222-CE、Rv0222-1509-2657c对于肺外结核有一定的诊断价值，其中Rv0222-1509-2657c-ELISA-ELISA准确性最高，能较好对非肺外结核进行诊断。 因此，本研究的四个蛋白抗原中 Rv0222-1509-2657c-ELISA对于临床上肺外结核病诊断的敏感性及其特异性最高。